전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.
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방법 논문
세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출
이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 에너지 생산, 지질 대사, 칼슘 항상성, 헴 생합성, 조절된 세포 사멸 및 활성 산소 종(ROS) 생성을 포함한 다양한 생물학적 기능에 필수적입니다. ROS는 주요 생물학적 과정에 필수적입니다. 그러나 통제되지 않으면 미토콘드리아 손상을 포함한 산화적 손상을 유발할 수 있습니다. 손상된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 방출하여 세포 손상과 질병 상태를 심화시킵니다. 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)이라는 항상성 과정은 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거한 다음 새로운 미토콘드리아로 대체합니다. 여러 미토파지 경로가 있으며, 일반적인 종점은 리소좀에서 손상된 미토콘드리아의 분해입니다.
유전자 센서, 항체 면역형광 및 전자 현미경을 포함한 여러 방법론에서 이 엔드포인트를 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 미토파지를 검사하는 각 방법은 특정 조직/세포 표적화(유전자 센서 사용) 및 매우 상세하게(전자 현미경 사용)와 같은 장점이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 고가의 자원, 훈련된 인력 및 형질전환 동물을 만드는 것과 같은 실제 실험 전에 긴 준비 시간이 필요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료를 사용하여 미토파지를 측정하기 위한 비용 효율적인 대안을 제시합니다. 이 방법은 선충 Caenorhabditis elegans 및 인간 간 세포에서 미토파지를 효과적으로 측정하며, 이는 다른 모델 시스템에서 잠재적인 효율성을 나타냅니다.
서론
미토콘드리아는 인간을 포함한 모든 호기성 동물에게 필수적입니다. 산화적 인산화를 통해 생체분자의 화학적 에너지를 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)으로 변환하고, 헴(hem)2을 합성하고, 산화β 산화3를 통해 지방산을 분해하고, 칼슘(calcium4)과 철(iron)5 항상성을 조절하고, 세포사멸(apoptosis)6에 의한 세포 사멸을 조절하며, 산화환원 항상성(redox homeostasis)7에 중요한 역할을 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. 두 가지 보완적이고 반대되는 과정은 미토콘드리아의 완전성과 적절한 기능을 유지합니다: 새로운 미토콘드리아 성분의 합성(생물 발생)과 미토콘드리아 자가포식(즉, 미토파지)을 통한 손상된 성분의 선택적 제거8.
여러 미토파지 경로는 PINK1/Parkin과 같은 효소와....
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프로토콜
참고: 독자의 편의를 위해 프로토콜을 두 부분으로 나눴습니다 : 하나는 예쁜꼬마선충의 미토파지 측정 프로토콜에 초점을 맞추고 다른 하나는 간 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 프로토콜에 초점을 맞춥니다. 재료 목록은 제공된 재료 표 에서 찾을 수 있습니다.
1. 예쁜꼬마선충 프로토콜
- 선충 성장 배지(NGM) 플레이트 및 대장균 OP50 박테리아 스톡 준비
참고: 명확히 하자면, NGM 플레이트 및 OP50 박테리아 스톡25,26의 준비에 대한 표준 프로토콜을 따랐지만 서로 다른 실험실 간에 이러한 프로토콜에 차이가 있을 수 있음을 알고 있습니다. 따라서 실험의 정확한 복제를 보장하기 위해 완전한 프로토콜을 포함했습니다.- pH 6에 도달할 때까지 ~150mL의 1M K 2HPO 4를 500mL의 1M KH2PO4 용액에 첨가하여 1M 인산칼륨 완충액, pH 6을 만듭니다. 버퍼를 0.22μm 진공 필터/보관 시스템에 통과....
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결과
VL-850을 사용한 예쁜꼬 마선충 벌레와 Hep-3B 세포 모두에서 강력한 미토파지 반응 유도
VL-850은 예 쁜꼬마선충 과 인간 각질형성세포(HaCaT 세포)를 산화 스트레스로부터 보호한다23. 그 작용 메커니즘을 더 자세히 탐구하기 위해 VL-850이 예쁜꼬마선충 및 기타 인간 세포에서 미토파지를 유도하는지 여부를 조사했습니다. 이를 테스트하기 위해 예쁜꼬마선충 (젊은 성인, L1 후 3일)을 62.5μM VL-850, 5μM FCCP(양성 대조군) 및 비히클(음성 대조군)에 6시간 동안 노출시켰습니다. 상기한 바와 같이, 염색 시약을 사용하여 미토파지를 측정하였다. VL-850에 62.5μM 농도를 사용하기로 한 이유는 지렁이를 산화 스트레스로부터 보호하고 수명을 크게 연장하기 때문입니다23. VL-850은 벌레의 머리 체벽 근육에 강력.......
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토론
다중 미토파지 경로는 다양한 단백질과 생체 분자(예: 카디오리핀29)를 포함합니다. 그러나 이러한 경로의 종점은 유사하며 리소좀 효소12,13에 의한 미토콘드리아의 분해입니다. 실제로 여러 방법에서 이 종점을 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 그러나 전자 현미경과 같은 일부 방법은 값비싼 장비, 훈련된 전문가, 표본 및 분석을 위한 연장된 준비 시간에 대한 접근을 요구합니다. 또한, 특정 조직/세포/세포하 구획에서 미토파지를 측정하는 것을 포함하는 미토파지 바이오센서를 사용하는 이점에도 불구하고, 이러한 센서의 발현은 세포(21)의 생리학을 변화시킬 수 있다. 따라서, 정상 세포 생리학에 대한 장기적인 간섭을 필요로 하지 않으면서 미토파지를 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고, 비용 효율적이며, 빠른 방법에 대한 요구가 존재한다.
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
원고를 비판적으로 읽고 의견과 조언을 해주신 Gross 연구소 구성원들에게 감사드립니다. 일부 균주를 제공한 국립 보건원 연구 인프라 프로그램 사무국(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에 감사드립니다. 이 연구는 Vitalunga Ltd와 Israel Science Foundation(보조금 번호 989/19)의 보조금으로 지원되었습니다. 그래픽 추상 그림(그림 1)은 BioRender.com 로 생성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 또는 자원 | |||
| 분석 저울 | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco 211705 | ||
| Bacto Yeast 추출물 | BD-Difco | 212750 | |
| 염화칼슘 | 시그마 | C1016 | |
| 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) | 시그마 | C2920 | |
| <강한>화학 | |||
| 콜레스트롤 | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM 고포도당 | 생물학 산업 | 01-055-1A | |
| 이중 증류수 (DDW) | |||
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS 열 비활성화 | Invitrogen | M7514 | |
| 글루테라데히드 (25 %) | Sigma | G5882 | |
| HEPES 버퍼 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L- 글루아타민 | Biological Industries | 03-020-1B | |
| 리소좀/미토콘드리아/핵 염색 Cytopainter 시약 | Abcam | ab139487 | |
| 황산마그네슘 | 시그마 | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| 파라포말리데히드(16%) | 전자 현미경 과학 | 15720 | |
| Poloxamer 188 용액 | 시그마 | P5556 | |
| 인산이수소칼 | Millipore | 1.04873.1000 | |
| 인산칼륨 이염기성 | 시그마 | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| 염화나트륨 | Bio-Lab | 1903059100 | |
| 수산화나트륨 | Gadot | 1310732 | |
| 인산나트륨 이염기성 도데카하이드레이트 | 시그마 | 4273 | |
| 테트라사이클린 하이드로클로 | 시그마 | 87128-25G | |
| 트립신-EDTA | 생물학 산업 | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-디아미노옥시-옥탄 | 특허< | ||
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| Deckglä ser 현미경 커버 유리 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
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| 리볼버, 조정 가능한 실험실 회전 장치, | Labnet | H5600 |
참고문헌
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insig....
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재인쇄 및 허가
