Detta protokoll beskriver olika metoder som kan hjälpa till i studien av ATG9A-biologi, inklusive immunofluorescens följt av bildanalys, övergående överuttryck och undersökning av ATG9A-glykosyleringsstatus med hjälp av western blot.
Autofagi är en mycket konserverad väg som cellen använder för att upprätthålla homeostas, bryta ner skadade organeller, bekämpa invaderande patogener och överleva patologiska tillstånd. En uppsättning proteiner, så kallade ATG-proteiner, utgör kärnan i autofagimaskineriet och arbetar tillsammans i en definierad hierarki. De senaste årens studier har förbättrat vår kunskap om autofagivägen. Nyligen har det föreslagits att ATG9A-vesiklar är kärnan i autofagi, eftersom de kontrollerar den snabba de novo-syntesen av en organell som kallas fagoforen. Studien av ATG9A har visat sig vara utmanande, eftersom ATG9A är ett transmembranprotein och det finns i olika membranfack. Att förstå dess handel är därför en viktig faktor för att förstå autofagi. Här presenteras detaljerade metoder som kan användas för att studera ATG9A och i synnerhet dess lokalisering med hjälp av immunofluorescenstekniker, som kan bedömas och kvantifieras. Fallgroparna med övergående överuttryck tas också upp. Den korrekta karakteriseringen av ATG9A-funktionen och standardiseringen av tekniker för att analysera dess trafik är avgörande för att ytterligare karakterisera de händelser som styr autofagiinitiering.
ATG9A är det enda transmembranproteinet i kärnautofagimaskineriet och transporteras mellan Golgi och ett cytosoliskt ATG9A-vesikelfack och passerar genom det endosomala facket1. ATG9A har länge varit gåtfull och har nyligen beskrivits fungera som en lipidförvränga, eftersom den balanserar lipider över membranlager 2,3. Det står nu klart att ATG9A befinner sig högst upp i hierarkin i autofagosombildning, och dess studier är därför avgörande för att förstå autofagi 4,5. Som sådan har ATG9A-vesiklar nyligen föreslagits som “frö” till autofagosomen 6,7. Tidigare studier har dock visat att ATG9A endast kortvarigt interagerar med den bildande autofagosomen i olika stadier av dess mognad och inte integrerar 6,8,9,10,11 i det autofagiska membranet. Således behövs ytterligare undersökningar för att helt reda ut ATG9A:s roll och potentiella multipla funktioner i autofagosombildning. Diskrepansen mellan de nuvarande modellerna och tidigare data kan dock endast lösas genom riktade experiment som adresserar smugglingen av ATG9A med hjälp av validerade kvantitativa metoder och intracellulära markörer.
Det finns olika verktyg som används för att studera ATG9A, var och en med fördelar och nackdelar, och användningen av dessa verktyg kompliceras av strukturen hos ATG9A, dess molekylära funktion och cellulär trafik 2,8,12. ATG9A bildar en homotrimer, glykosyleras och transporteras genom cellen till kompartment som Golgi, endosomerna och plasmamembranet13,14. Med tanke på dess komplexa resväg finns det flera utmaningar när det gäller att tolka avläsningar som ATG9A-spridning från Golgi vid specifika behandlingar eller stimuli (såsom närings- och serumsvält). ATG9A är extremt dynamisk när det gäller vesikulär trafik; Faktum är att ATG9A-innehållande vesiklar har definierats som ATG9A-kompartmentet i samband med svältinducerad autofagi. ATG9A-facket, som bildas av dessa dynamiska vesiklar, interagerar tillfälligt med flera intracellulära organeller 8,15,16,17. De tekniker som beskrivs här, inklusive immunofluorescens, levande avbildning och glykosyleringsanalyser, bör hjälpa till att upptäcka och förstå ATG9A-biologi. I synnerhet kommer de tillvägagångssätt som beskrivs i den här artikeln att hjälpa till att ta itu med frågor om lokalisering till specifika cellulära kompartment och interaktioner med specifika proteinpartners och/eller membrankompartment. Eftersom ATG9A hydrofob bevarad kärndomän (PFAM-domän PF04109) har en unik topologi och ATG9A cyklar mellan flera membranfack, bör forskare vara medvetna om vissa fallgropar och artefakter vid överuttryck av ATG9A, inklusive, men inte begränsat till, endoplasmatiskt retikulum (ER) retention. Andra möjliga problem kan uppstå på grund av felveckning av proteinet, artefaktisk aggregering under normala odlingsförhållanden eller otillräcklig detektion av vesikulärkompartmentet på grund av suboptimala permeabiliseringsprotokoll för immunofluorescens.
Vid avbildning av endogent ATG9A måste försiktighet iakttas vid provberedning och bildtagning för att säkerställa kvaliteten på den efterföljande kvantitativa analysen och korrekt tolkning av data. Att kombinera de tekniker som beskrivs i den här artikeln med vanliga biokemiska metoder (såsom immunprecipitering eller pull-down-experiment som inte beskrivs här) bör förbättra vår förståelse av ATG9A-funktionen. Denna experimentella verktygslåda är avsedd att hjälpa nya forskare att navigera i några av de analyser som krävs för att bestämma funktionen av ATG9A i deras biologiska system.
Denna studie illustrerar de olika verktyg som kan användas för att undersöka ATG9A-lokalisering. För det första beskriver denna studie hur ATG9A kan visualiseras genom immunofluorescens och hur detta kan kvantifieras. För det andra jämförs strategier som kan användas för att märka ATG9A med en fluorescerande markör för visualisering i antingen fasta eller levande celler. Slutligen beskriver detta arbete hur man undersöker och använder glykosyleringstillståndet för ATG9A för att avgöra om ATG9A har lämnat ER och trafikerat genom Golgi.
När det gäller karakterisering av endogen ATG9A-lokalisering genom immunofluorescens måste försiktighet iakttas med de fixerings- och permeabiliseringsmetoder som används för experimentet. Enligt de standardprocedurer som beskrivs här är paraformaldehydfixering i kombination med digitoninpermeabilisering goda förutsättningar för att visualisera både Golgi-associerade ATG9A- och ATG9A-positiva vesiklar7. Tillsammans med fixering och permeabilisering är tidpunkten för inkubation med den primära antikroppslösningen också kritisk. Vi har observerat, men inte dokumenterat, att högre koncentrationer av primär antikroppslösning och längre inkubationstider kan leda till en missvisande ökning av Golgi-färgningen av ATG9A, vilket så småningom äventyrar detektionen av ATG9A-omfördelning till andra membranfack. Dessutom, eftersom ATG9A finns i många intracellulära fack 1,13,17,22,23,24,27,28, är det viktigt att använda specifika membranmarkörer, tillsammans med ATG9A, för att identifiera var ATG9A är placerad. Flera metoder har tidigare använts för att kvantifiera ATG9A-lokalisering, inklusive Pearsons korrelationskoefficient för samlokalisering29. Den partiella överlappningen av ATG9A med Golgi och det distinkta vesikulära facket leder dock till ett stort antal pixelavvikelser, vilket kan snedvrida tolkningen av korrelationskoefficienten. Av denna anledning föredras ett mer förenklat tillvägagångssätt baserat på förhållandet mellan medelfluorescensen i de två fack som ska analyseras, och detta tillvägagångssätt är mindre känsligt för cell-för-cell-variabilitet. För ytterligare information om bildanalys genom mikroskopi hänvisas läsarna till denna bok kapitel30.
När man undersöker glykosyleringsstatusen för ATG9A är valet av geler för att köra western blots viktigt. För detta protokoll är 3%-8% Tris-acetatgeler att föredra eftersom de erbjuder den högsta upplösningen för större proteiner, men alternativa gelkompositioner eller löpande buffertar som erbjuder en bra separation av proteiner med hög molekylvikt kan också användas. Experimentatorn kan säkerställa maximal separation av proteiner genom att öka tiden för elektrofores.
Vid beredning av proverna för att visualisera ATG9A på western blot, bör försiktighet iakttas så att proverna inte kokas efter tillsats av Lapemmi-bufferten. kokning vid 95 °C inducerar bildandet av ATG9A-aggregat, och följaktligen migrerar ATG9A inte effektivt in i gelen1. Att värma proverna vid 65 °C i 5 minuter rekommenderas27.
Höga nivåer av transfektion leder vanligtvis till högre ackumulering av ATG9A i ER, medan måttliga uttrycksnivåer hjälper den fysiologiska lokaliseringen av proteinet. Anekdotiskt sett bidrar inkubationstider på 72 timmar i stället för 48 timmar ofta till att minska ER-lokaliseringsartefakter. Framför allt kan mRFP-ATG9A korrekt rapportera om ATG9A-trafik och funktion om nivåerna kontrolleras genom uttrycksnivåer eller genom att använda stabila cellinjer 8,9,22,27.
Misslyckandet hos en population av överuttryckt ATG9A att förvärva mogna N-bundna glykaner kan användas som en avläsning för störd ATG9A-handel. Vid mutering eller radering av vissa regioner av ATG9A finns det en risk för ökad ER-retention, vilket kan leda till att man inte förvärvar mogna N-bundna glykaner och därmed ett snabbare migrerande ATG9A-band på western blot. Forskare som arbetar med trunkerade ATG9A-konstruktioner bör kontrollera om det finns ER-retention, glykosyleringstillstånd och Golgi-lokalisering.
För avbildning av levande celler av ATG9A ger ett Airyscan-mikroskop, som förlitar sig på den snabba Airyscan-funktionen, optimal upplösning på vanligtvis cirka 120 nm. För lokaliseringsnoggrannhet är bildhastigheter på cirka 1–2 bilder per sekund (fps) i superupplösningsläge optimala beroende på hur många kanaler som avbildas. Liknande konfokalmikroskop som kan avbilda i hög hastighet kan också användas för avbildning av ATG9A-vesiklar; Det bör dock noteras att bildhastigheten direkt kan påverka upptäckten av händelser och därför påverka tolkningen av data.
Sammanfattningsvis beskriver de presenterade protokollen sätt att kvantifiera och karakterisera ATG9A-lokalisering genom immunofluorescens, levande cellmikroskopi och dess glykosyleringsstatus. Dessa protokoll kan hjälpa forskare som arbetar med ATG9A och hjälpa till att undvika vissa fallgropar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Rocco D’Antuono för korrekturläsning av aspekter av manuskriptet, liksom alla nuvarande och tidigare medlemmar i labbet för molekylär cellbiologi av autofagi (MCBA) för diskussionerna som ledde till förfiningen av dessa protokoll. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, stöddes av Francis Crick Institute som får sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (CC2134), UK Medical Research Council (CC2134). Denna forskning finansierades helt eller delvis av Wellcome Trust (CC2134). För open access-ändamål har författaren tillämpat en CC BY-licens för offentlig upphovsrätt för alla manuskriptversioner som accepterats av författaren till följd av detta bidrag.
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |