I betragtning af deres enkle anatomi tilbyder Anopheles testikler en god cytologisk model til undersøgelse af spermatogenese. Denne protokol beskriver helmonteret fluorescens in situ-hybridisering , en teknik, der bruges til at undersøge denne biologiske proces, samt fænotypen af transgene stammer, der huser mutationer i de gener, der er involveret i sædproduktionen.
Spermatogenese er en kompleks biologisk proces, hvor diploide celler gennemgår successiv mitotisk og meiotisk opdeling efterfulgt af store strukturelle ændringer til dannelse af haploide spermatozoer. Ud over det biologiske aspekt er undersøgelse af spermatogenese af afgørende betydning for forståelse og udvikling af genetiske teknologier såsom gendrev og syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, som ved at ændre henholdsvis Mendelsk arv og sædkønsforholdet kan bruges til at kontrollere skadedyrsinsektpopulationer. Disse teknologier har vist sig at være meget lovende i laboratorieindstillinger og kan potentielt bruges til at kontrollere vilde populationer af Anopheles myg, som er vektorer af malaria. På grund af testiklernes anatomiske enkelhed og deres medicinske betydning repræsenterer Anopheles gambiae, en vigtig malariavektor i Afrika syd for Sahara, en god cytologisk model til undersøgelse af spermatogenese. Denne protokol beskriver, hvordan helmonteret fluorescens in situ hybridisering (WFISH) kan bruges til at studere de dramatiske ændringer i cellekernestruktur gennem spermatogenese ved hjælp af fluorescerende sonder, der specifikt pletter X- og Y-kromosomerne. FISH kræver normalt forstyrrelse af reproduktive organer for at udsætte mitotiske eller meiotiske kromosomer og tillade farvning af specifikke genomiske regioner med fluorescerende sonder. WFISH muliggør bevarelse af testiklernes oprindelige cytologiske struktur kombineret med et godt niveau af signaldetektion fra fluorescerende sonder rettet mod gentagne DNA-sekvenser. Dette gør det muligt for forskere at følge ændringer i kromosomadfærden hos celler, der gennemgår meiose langs organets struktur, hvor hver fase af processen tydeligt kan skelnes. Denne teknik kan være særlig nyttig til at studere kromosommeiotisk parring og undersøge de cytologiske fænotyper forbundet med for eksempel syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, hybrid mandlig sterilitet og knock-out af gener involveret i spermatogenese.
Malaria pålægger en enorm byrde for den globale menneskelige befolknings sundhed og trivsel. I 2021 vurderede Verdenssundhedsorganisationen (WHO), at malaria forårsagede 619,000 dødsfald, hvoraf 96% forekom i Afrika syd for Sahara1. Sygdommen overføres af myg, der tilhører Anopheles-slægten, og i Afrika syd for Sahara har tre arter, nemlig Anopheles gambiae (An. gambiae), Anopheles coluzzi (An, coluzzi) og Anopheles arabiensis (An. Arabiensis) en uforholdsmæssig stor rolle i malariaoverførsel og tegner sig for 95% af malariatilfældene globalt. Kontrolprogrammer, der er afhængige af traditionelle metoder såsom insekticider og malariamedicin, har reddet millioner af liv; I de senere år har den stigende resistens over for disse kontrolmetoder imidlertid udfordret deres effektivitet 1,2. Derudover har restriktioner pålagt af COVID-19-pandemien påvirket tilgængeligheden af vigtige malariakontrolinterventioner, hvilket ifølge WHO World Malaria Report 2022 har øget malariaforekomsten1. I de sidste to årtier er der udviklet nye genetiske kontrolmetoder i laboratorieindstillinger for at målrette Anopheles myg 3,4,5,6,7,8,9,10. Blandt disse strategier synes dem, der er baseret på gendrevsystemer (GDS’er) og syntetiske kønsforholdsforvrængere (SD’er), lovende. GDS’er er afhængige af muligheden for at overføre med meget høj frekvens en genetisk modifikation, der påvirker kvindelig fertilitet eller forringer parasitens livscyklus i myggen 5,11,12. SD’er virker i stedet ved at skæve kønsforholdet mellem et mygafkom mod mænd, hvilket over tid fører til sammenbruddet af en målpopulation på grund af mangel på kvinder 4,6,13. Hovedkomponenterne i disse genetiske systemer virker primært på myggenes reproduktive organer, hvor kønsceller, æg og sædceller produceres efter meiotisk division14.
I denne protokol anvendes fremskridt inden for cytogenetiske teknikker til at udforske spermatogenese i An. gambiae med fokus på kromosomernes adfærd in situ. Strukturen af mygtestiklerne og de biologiske processer, der finder sted i den, er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af en række cytologiske metoder, såsom immunofluorescens, fluorescerende reportertransgener og DNA- og RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH)15,16,17,18,19,20; Organerne viser en spindellignende form, hvor den nederste pol er fastgjort til en deferent kanal forbundet med de mandlige tilbehørskirtler. I den øverste pol spredes kimlinjestamcellernes niche og differentieres til spermatogonia-celler indlejret i spermatocyster dannet af somatiske celler. Efter flere runder af mitotisk opdeling differentieres spermatogonien til spermatocytter, som går ind i meiose. Ved profase parres autosom- og kønskromosomer med deres homologer, og krydsning finder sted. Efter de meiotiske opdelinger genereres runde haploide spermatider og går ind i spermiogenese, og denne proces fører til dannelsen af modne haploide spermatozoer, hvor cytoplasmaet er fjernet, det nukleare kromatin kondenseres, og flageller dukker op ved den basale del af kernerne21,22 (figur 1 og figur 2).
Generelt starter spermiogenese omkring midten af puppestadiet, og modne spermatozoer kan påvises i det sene puppestadium i sædreservoiret23. Modningsprocessen af spermatocysterne fortsætter i voksenlivet23,24,25. I Anopheles testikler kan hvert trin af spermatogenese let identificeres ved at se på cellernes nukleare morfologi i hver spermatocyst (figur 2). Helmonteret fluorescens in situ hybridisering (WFISH), beskrevet i denne protokol, giver forskere mulighed for specifikt at mærke en kromosomal region og spore den under spermatogenese, samtidig med at organets og cellekernernes oprindelige struktur bevares; dette repræsenterer en fordel sammenlignet med standard DNA FISH-protokollen, hvor organet normalt klemmes, hvilket fører til vævsskade19. I den nuværende protokol bruges fluorescerende sonder til at plette gentagne sekvenser på kønskromosomerne og dermed spore deres adfærd under spermatogenese, fra diploide delende celler til modne haploide spermatozoer. WFISH kan være særlig nyttig til at studere meiotisk parring af kønskromosomer og undersøge de cytologiske fænotyper forbundet med for eksempel syntetiske kønsforholdsforvrængningsmidler, hybrid mandlig sterilitet og knock-out af gener involveret i spermatogenese 4,19,26,27.
I betragtning af deres rolle som malariavektorer er Anopheles-myg målet for et stigende antal genetiske vektorkontrolstrategier, som ofte virker i disse organismers reproduktive organer. Flere myggenutanter og cytologiske fænotyper er blevet genereret, der kræver nye cytologiske teknikker, der skal undersøges26,27,28,29. Metoden beskrevet i denne undersøgelse kaster lys over forståelsen af spermatogenese samt de cytologiske mekanismer bag genetiske strategier, der har potentiale til at kontrollere malariaoverførende myg.
Almindeligvis kræver FISH-protokoller klemning af det interessante organ for at muliggøre kromosomfarvning. Dette medfører tab af information om det rumlige arrangement af cellerne i dette organ33. Denne protokol beskriver, hvordan biologiske processer, såsom spermatogenese, kan studeres in situ, samtidig med at testiklernes intakte native struktur og dens interne cytologiske organisation opretholdes. Sonder rettet mod forskellige DNA-gentagne elementer, som er særligt beriget i kønskromosomer20, kan samtidig bruges til at afsløre dynamikken i sædmodning. Afhængigt af tidspunktet for testisdissektionen giver WFISH mulighed for at studere forskellige stadier af spermatogenese gennem mygudvikling. WFISH er nyttig til at studere specifikke fænomener såsom hybrid inkompatibilitet, som i Anopheles myg skyldes tilstedeværelsen af meiotiske defekter såsom præmeiotisk svigt og kønskromosom ikke-disjunktion 19,34,35. Udover det biologiske aspekt er spermatogenese målet for en række genetiske strategier udviklet til bekæmpelse af skadedyrsinsekter som Anopheles myg. I denne sammenhæng er det X-bundne rDNA-locus af An. gambiae blevet brugt som et mål for at udvikle en syntetisk kønsforholdsforvrængning, som ved at beskadige X-bærende sædceller skævvrider afkom mod mænd 4,8,13.
Denne teknologi afspejler virkningen af naturlige kønsforhold meiotiske drev, der er blevet identificeret i flere taxa, herunder myg, men som stadig er dårligt forstået 28,36,37,38,39,40,41. WFISH giver mulighed for at undersøge dette fænomen og baner vejen for at forfine eller forbedre kønsforvrængningsbaserede genetiske strategier ved for eksempel at give information om, hvordan sædproduktionens cytologi påvirkes af valget af de målsteder, der anvendes til kønskromosommakulering. Selvom WFISH efter vores erfaring viser store chancer for succes, kan der stadig forekomme fiasko. Dette kan skyldes et ineffektivt niveau af vævspermeabilisering, som kan overvindes ved at øge inkubationstiden for den penetrerende opløsning. Alternativt kan proteinase K anvendes under permeabiliseringstrinnet. I nogle tilfælde bemærkede vi et ikke-ensartet niveau af sondeindtrængning med et højere signal i spermatocytkerner og et lavere eller fraværende signal i meiotiske og spermiogenese stadier. Dette kan skyldes en forskel i permeabiliseringsniveauet afhængigt af cellestadiet. Derudover viste WFISH sig at være værdifuld, når man brugte fluorescerende sonder designet til at målrette DNA-sekvenser, der var til stede i høje kopinumre. Når man målretter mod enkeltkopigener, er signaldetekteringen muligvis ikke tilstrækkelig. I dette tilfælde skal metoder til signalforstærkning, såsom tyramidsignalforstærkning (TSA), integreres42.
Denne protokol kunne kombineres med immunfarvning eller med transgene reporterstammer, der huser kimlinjespecifikke fluorescerende markører16,18, da dette ville tilføje information om proteinlokalisering og genekspression in situ. I dette arbejde beskrives WFISH som en teknik til at undersøge spermatogenese i Anopheles myg; Men i betragtning af den fælles anatomi af mandlige reproduktive organer kunne denne protokol anvendes på andre myggearter, der spiller en rolle i sygdomsoverførsel. På samme måde kunne kvindelig gametogenese undersøges ved hjælp af denne teknik. Derudover kunne cytologiske undersøgelser i organer eller væv af interesse, såsom myggens midgut, som er et mål for parasitinvasion, eller atypiske genetiske baggrunde, såsom dem i hybridmyg, udforskes43. Desuden kan denne teknik potentielt overføres til andre organismer inden for Diptera-ordenen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Bill & Melinda Gates Foundation og Open Philanthropy. Vi takker Facility for Imaging by Light Microscopy (FILM) ved Imperial College London for mikroskopianalysen. Figur 2 blev oprettet med Biorender.com.
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
Primer sequences | |||
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |