Normothermic ex vivo liver machine perfusión en ratón
Summary
Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.
Abstract
Este protocolo presenta un sistema NEVLP optimizado libre de eritrocitos utilizando hígados de ratón. La preservación ex vivo de hígados de ratón se logró mediante el empleo de cánulas modificadas y técnicas adaptadas de equipos comerciales convencionales de perfusión ex vivo . El sistema se utilizó para evaluar los resultados de preservación después de 12 h de perfusión. Los ratones C57BL / 6J sirvieron como donantes de hígado, y los hígados fueron explantados canulando la vena porta (PV) y el conducto biliar (BD), y posteriormente enjuagando el órgano con solución salina heparinizada tibia (37 ° C). Luego, los hígados explantados se transfirieron a la cámara de perfusión y se sometieron a perfusión normotérmica oxigenada de máquina (NEVLP). Las muestras de perfusión de entrada y salida se recogieron a intervalos de 3 h para el análisis de perfusión. Al finalizar la perfusión, se obtuvieron muestras de hígado para el análisis histológico, con integridad morfológica evaluada mediante Suzuki-Score modificado a través de tinción de Hematoxilina-Eosina (HE). Los experimentos de optimización arrojaron los siguientes hallazgos: (1) los ratones que pesaban más de 30 g se consideraron más adecuados para el experimento debido al mayor tamaño de su conducto biliar (BD). (2) una cánula de poliuretano de 2 Fr (diámetro exterior = 0,66 mm) fue más adecuada para canular la vena porta (PV) en comparación con una cánula de polipropileno. Esto se atribuyó al agarre mejorado del material de poliuretano, lo que resultó en un deslizamiento reducido del catéter durante la transferencia del cuerpo a la cámara del órgano. (3) para la canulación del conducto biliar (BD), se encontró que una cánula de poliuretano de 1 Fr (diámetro exterior = 0,33 mm) era más efectiva en comparación con la cánula de polipropileno UT – 03 (diámetro exterior = 0,30 mm). Con este protocolo optimizado, los hígados de ratón se conservaron con éxito durante 12 h sin un impacto significativo en la estructura histológica. La tinción de hematoxilina-eosina (HE) reveló una arquitectura morfológica bien conservada del hígado, caracterizada por hepatocitos predominantemente viables con núcleos claramente visibles y dilatación leve de sinusoides hepáticos.
Introduction
El trasplante de hígado representa el tratamiento estándar de oro para las personas con enfermedad hepática terminal. Lamentablemente, la demanda de órganos de donantes supera la oferta disponible, lo que lleva a una escasez significativa. En 2021, aproximadamente 24,936 pacientes estaban en la lista de espera para un injerto de hígado, mientras que solo 9,234 trasplantes se realizaron con éxito1. La disparidad significativa entre la oferta y la demanda de injertos hepáticos destaca la necesidad apremiante de investigar estrategias alternativas para ampliar el grupo de donantes y mejorar la accesibilidad de los injertos hepáticos. Una forma de ampliar el grupo de donantes es utilizar donantes marginales2. Los donantes marginales incluyen aquellos con edad avanzada, esteatosis moderada o grave. Aunque el trasplante de órganos marginales puede producir resultados favorables, los resultados generales siguen siendo subóptimos. Como resultado, el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a mejorar la función de los donantes marginales está actualmente en marcha 3,4.
Una de las estrategias es utilizar la máquina de perfusión, especialmente la perfusión normotérmica oxigenada de máquina, para mejorar la función de estos órganos marginales5. Sin embargo, todavía hay una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos beneficiosos de la perfusión normotérmica oxigenada de la máquina (NEVLP). Los ratones, con su abundante disponibilidad de cepas modificadas genéticamente, sirven como modelos valiosos para investigar las vías moleculares. Por ejemplo, la importancia de las vías de autofagia en la mitigación de la lesión por isquemia-reperfusión hepática ha sido cada vez más reconocida 6,7. Una vía molecular importante en la lesión por isquemia-reperfusión hepática es la vía miR-20b-5p/ATG78. Actualmente, hay una serie de cepas de ratón knockout ATG y knock-out condicional disponibles, pero no hay cepas de rata correspondientes9.
Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo era generar una plataforma NEVLP miniaturizada para injertos hepáticos de ratón. Esta plataforma facilitaría la exploración y evaluación de posibles estrategias modificadas genéticamente destinadas a mejorar la funcionalidad del hígado del donante. Además, era esencial que el sistema fuera adecuado para la perfusión a largo plazo, permitiendo el tratamiento ex vivo del hígado, comúnmente conocido como “reparación de órganos”.
Teniendo en cuenta la disponibilidad limitada de datos in vitro relevantes sobre la perfusión hepática en ratones, la revisión de la literatura se centró en estudios realizados en ratas. Se realizó una búsqueda sistemática de literatura que abarca de 2010 a 2022 utilizando palabras clave como “perfusión hepática normotérmica”, “ex vivo o in vitro” y “ratas“. Esta búsqueda tuvo como objetivo identificar las condiciones óptimas en roedores, lo que nos permitió determinar el enfoque más adecuado.
El sistema de perfusión consiste en un depósito amortiguador de vidrio sellado con camisa de agua, una bomba de rodillos peristáltica, un oxigenador, una trampa de burbujas, un intercambiador de calor, una cámara de órganos y un sistema de tubos de ciclo cerrado (Figura 1). El sistema garantiza un mantenimiento preciso de una temperatura de perfusión constante de 37 °C utilizando una máquina termostática dedicada. La bomba de rodillos peristálticos impulsa el flujo del perfusión en todo el circuito. El circuito de perfusión se inicia en el depósito aislado con camisa de agua. Posteriormente, el perfusato se dirige a través del oxigenador, que recibe una mezcla de gases de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono de una botella de gas dedicada. Después de la oxigenación, el perfusato pasa a través de la trampa de burbujas, en la que cualquier burbuja atrapada es redirigida de nuevo al depósito por la bomba peristáltica. El perfusión restante fluye a través del intercambiador de calor y entra en la cámara del órgano, desde donde regresa al depósito.
Aquí, informamos nuestras experiencias estableciendo un NEVLP para hígados de ratón y compartimos los resultados prometedores de un experimento piloto realizado utilizando el medio oxigenado sin portadores de oxígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Los dos pasos cruciales en la explantación hepática son la canulación de la vena porta (PV) y la posterior canulación del conducto biliar (BD). Estos pasos son de suma importancia para garantizar el éxito de la recuperación de órganos y los procedimientos posteriores de perfusión o trasplante.
Desafíos y soluciones
La canulación PV presenta tres desafíos: lesión de la pared del vaso, desplazamiento del catéter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A lo largo de la redacción de este documento, he recibido un gran apoyo y asistencia. Me gustaría agradecer especialmente a mi compañero de equipo XinPei Chen por su maravillosa colaboración y apoyo paciente durante mi operación.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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