نورموذرميك خارج الجسم الحي آلة الكبد التروية في الماوس
Summary
تم إنشاء نظام نضح الكبد خارج الجسم الحي (NEVLP) لكبد الفئران. يتطلب هذا النظام خبرة في الجراحة المجهرية ولكنه يسمح بنتائج نضح قابلة للتكرار. تسهل القدرة على استخدام كبد الفأر التحقيق في المسارات الجزيئية لتحديد إضافات الفوسات الجديدة وتمكن من تنفيذ التجارب التي تركز على إصلاح الأعضاء.
Abstract
يقدم هذا البروتوكول نظام NEVLP الخالي من كريات الدم الحمراء باستخدام كبد الفأر. تم تحقيق الحفاظ على كبد الفأر خارج الجسم الحي من خلال استخدام قنيات معدلة وتقنيات مقتبسة من معدات التروية التجارية التقليدية خارج الجسم الحي. تم استخدام النظام لتقييم نتائج الحفظ بعد 12 ساعة من التروية. عملت الفئران C57BL / 6J كمتبرعين بالكبد ، وتم زرع الكبد عن طريق قنية الوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية (BD) ، وبعد ذلك غسل العضو بمحلول ملحي دافئ (37 درجة مئوية). بعد ذلك ، تم نقل الكبد المزروع إلى غرفة التروية وإخضاعه للنضح الآلي المؤكسج الطبيعي الحرارة (NEVLP). تم جمع عينات المدخل والمخرج على فترات 3 ساعات لتحليل البيروسات. عند الانتهاء من التروية ، تم الحصول على عينات من الكبد للتحليل النسيجي ، مع تقييم السلامة المورفولوجية باستخدام سوزوكي سكور المعدل من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين (HE). أسفرت تجارب التحسين عن النتائج التالية: (1) اعتبرت الفئران التي يزيد وزنها عن 30 جراما أكثر ملاءمة للتجربة بسبب الحجم الأكبر للقناة الصفراوية (BD). (2) كانت قنية البولي يوريثين 2 Fr (القطر الخارجي = 0.66 مم) أكثر ملاءمة لقنية الوريد البابي (PV) عند مقارنتها بقنية البولي بروبلين. ويعزى ذلك إلى القبضة المعززة لمادة البولي يوريثين ، مما أدى إلى تقليل انزلاق القسطرة أثناء النقل من الجسم إلى غرفة الأعضاء. (3) لقنية القناة الصفراوية (BD) ، تم العثور على قنية 1 Fr (القطر الخارجي = 0.33 مم) من مادة البولي يوريثين لتكون أكثر فعالية مقارنة بقنية البولي بروبلين UT – 03 (القطر الخارجي = 0.30 مم). مع هذا البروتوكول الأمثل ، تم الحفاظ على كبد الفأر بنجاح لمدة 12 ساعة دون تأثير كبير على البنية النسيجية. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوسين (HE) عن بنية مورفولوجية محفوظة جيدا للكبد ، تتميز بخلايا كبدية قابلة للحياة في الغالب مع نوى مرئية بوضوح وتمدد خفيف للجيوب الأنفية الكبدية.
Introduction
تمثل زراعة الكبد العلاج القياسي الذهبي للأفراد المصابين بأمراض الكبد في المرحلة النهائية. ومما يؤسف له أن الطلب على الأعضاء المانحة يتجاوز العرض المتاح، مما يؤدي إلى نقص كبير. في عام 2021 ، كان ما يقرب من 24,936 مريضا على قائمة الانتظار للحصول على ترقيع الكبد ، بينما تم إجراء 9,234 عملية زرع فقط بنجاح1. يسلط التفاوت الكبير بين العرض والطلب على ترقيع الكبد الضوء على الضرورة الملحة للتحقيق في استراتيجيات بديلة لتوسيع مجموعة المانحين وتعزيز إمكانية الوصول إلى ترقيع الكبد. تتمثل إحدى طرق توسيع مجموعة المانحين في استخدام المانحينالهامشيين 2. يشمل المتبرعون الهامشيون أولئك الذين يعانون من تقدم العمر أو التنكس الدهني المعتدل أو الشديد. على الرغم من أن زرع الأعضاء الهامشية قد يؤدي إلى نتائج إيجابية ، إلا أن النتائج الإجمالية تظل دون المستوى الأمثل. ونتيجة لذلك ، يجري حاليا تطوير استراتيجيات علاجية تهدف إلى تعزيز وظيفة المانحين الهامشيين 3,4.
تتمثل إحدى الاستراتيجيات في استخدام التروية الآلية ، وخاصة التروية الآلية المؤكسجة ذات الحرارة العادية ، لتحسين وظيفة هذه الأعضاء الهامشية5. ومع ذلك ، لا يزال هناك فهم محدود للآليات الجزيئية التي تكمن وراء الآثار المفيدة للنضح الآلي المؤكسج الطبيعي الحرارة (NEVLP). الفئران ، مع توافرها الوفير من السلالات المعدلة وراثيا ، بمثابة نماذج قيمة للتحقيق في المسارات الجزيئية. على سبيل المثال ، تم التعرف بشكل متزايد على أهمية مسارات الالتهام الذاتي في التخفيف من إصابة نقص التروية الكبدية 6,7. أحد المسارات الجزيئية المهمة في إصابة نقص التروية الكبدية هو مسار miR-20b-5p / ATG78. حاليا ، هناك عدد من سلالات ATG بالضربة القاضية والضربة القاضية الشرطية المتاحة ولكن لا توجد سلالات الفئران المقابلة9.
بناء على هذه الخلفية ، كان الهدف هو إنشاء منصة NEVLP مصغرة لترقيع كبد الفئران. ستسهل هذه المنصة استكشاف وتقييم الاستراتيجيات المعدلة وراثيا المحتملة التي تهدف إلى تحسين وظائف كبد المتبرع. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الضروري أن يكون النظام مناسبا للتروية على المدى الطويل ، مما يتيح العلاج خارج الجسم الحي للكبد ، والذي يشار إليه عادة باسم “إصلاح الأعضاء”.
بالنظر إلى محدودية توافر البيانات ذات الصلة في المختبر حول نضح كبد الفئران ، ركزت مراجعة الأدبيات على الدراسات التي أجريت على الفئران. تم إجراء بحث منهجي للأدبيات يمتد من عام 2010 إلى عام 2022 باستخدام كلمات رئيسية مثل “نضح الكبد الطبيعي الحرارة” و “خارج الجسم الحي أو في المختبر” و “الفئران“. يهدف هذا البحث إلى تحديد الظروف المثلى في القوارض ، مما يسمح لنا بتحديد النهج الأنسب.
يتكون نظام الإرواء من خزان عازل زجاجي مغلق مغلف بالماء ، ومضخة أسطوانية تمعجية ، وأكسجين ، ومصيدة فقاعات ، ومبادل حراري ، وغرفة عضو ، ونظام أنابيب ركوب دراجات مغلق (الشكل 1). يضمن النظام الصيانة الدقيقة لدرجة حرارة التروية الثابتة التي تبلغ 37 درجة مئوية باستخدام آلة ثابتة حراري مخصصة. تدفع المضخة الدوارة التمعجية تدفق البيرفوسات في جميع أنحاء الدائرة. تبدأ دائرة التروية في الخزان المعزول المغلف بالماء. بعد ذلك ، يتم توجيه perfusate من خلال جهاز الأكسجين ، الذي يتلقى خليط غاز من 95 ٪ من الأكسجين و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون من زجاجة غاز مخصصة. بعد الأوكسجين ، يمر البيروزيت عبر مصيدة الفقاعات ، حيث يتم إعادة توجيه أي فقاعات محاصرة مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتدفق البيرفوسات المتبقي عبر المبادل الحراري ويدخل غرفة العضو ، حيث يعود إلى الخزان.
هنا ، نبلغ عن تجاربنا في إنشاء NEVLP لكبد الفئران ونشارك النتائج الواعدة لتجربة تجريبية أجريت باستخدام الوسط المؤكسج بدون حاملات الأكسجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
الخطوتان الحاسمتان في زراعة الكبد هما قنية الوريد البابي (PV) والقنية اللاحقة للقناة الصفراوية (BD). هذه الخطوات ذات أهمية قصوى في ضمان استرجاع الأعضاء بنجاح وإجراءات التروية أو الزرع اللاحقة.
التحديات والحلول
يمثل القنية ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
طوال كتابة هذه الورقة ، تلقيت قدرا كبيرا من الدعم والمساعدة. أود بشكل خاص أن أعرب عن تقديري لزميلي في الفريق XinPei Chen لتعاونه الرائع ودعمه الصبور أثناء عمليتي.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
