यह पांडुलिपि मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) में एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के माध्यम से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने और पोडोसाइट्स में बाद में भेदभाव करने के लिए दो-चरणीय प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।
पोडोसाइट्स ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा के मूत्र स्थल पर बैठे उपकला कोशिकाएं हैं जो ग्लोमेरुलस के चयनात्मक फ़िल्टर फ़ंक्शन में योगदान करती हैं। पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन फोकल सेगमेंट ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस (एफएसजीएस) का कारण बन सकता है, और पोडोसाइट्स कई अन्य प्राथमिक और माध्यमिक नेफ्रोपैथी में भी प्रभावित होते हैं। उनकी विभेदित प्रकृति के कारण, प्राथमिक सेल कल्चर मॉडल पोडोसाइट्स के लिए सीमित हैं। इसलिए, आमतौर पर सशर्त रूप से अमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन सशर्त रूप से अमर पोडोसाइट्स (सिपोडोसाइट्स) की कई सीमाएं हैं: कोशिकाएं संस्कृति में अंतर कर सकती हैं, खासकर जब वे सामंजस्य तक पहुंचती हैं, और कई पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर या तो केवल थोड़ा या बिल्कुल भी व्यक्त नहीं होते हैं। यह शारीरिक, पैथोफिजियोलॉजिकल और नैदानिक पहुंच के लिए सिपोडोसाइट्स के उपयोग और उनकी प्रयोज्यता को सवाल में लाता है। यहां, हम मानव पोडोसाइट्स की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- जिसमें रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स शामिल हैं- त्वचा पंच बायोप्सी से त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग द्वारा एचआईपीएससी में और बाद में पोडोसाइट्स में विभेदन। ये पोडोसाइट्स विवो पोडोसाइट्स में रूपात्मक विशेषताओं के मामले में बहुत बेहतर दिखते हैं, जैसे पैर प्रक्रियाओं का विकास और पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति। अंत में, फिर भी महत्वपूर्ण रूप से, ये कोशिकाएं रोगियों के उत्परिवर्तन को बनाए रखती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक व्यक्तिगत दृष्टिकोण में पोडोसाइट्स रोगों और संभावित चिकित्सीय पदार्थों का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर पूर्व विवो मॉडल होता है।
पोडोसाइट्स विशेष, पोस्ट-माइटोटिक रीनल एपिथेलियल कोशिकाएं हैं जो ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली (जीबीएम), ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और ग्लाइकोकैलिक्स के साथ गुर्दे के ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा का निर्माण करती हैं। फेनोटाइपिक रूप से, पोडोसाइट्स में एक कोशिका शरीर और प्राथमिक, सूक्ष्मनलिका-संचालित झिल्ली एक्सटेंशन होते हैं, साथ ही द्वितीयक एक्सटेंशन होते हैं जिन्हें पैर प्रक्रिया 1,2 कहा जाता है। ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा जो रक्त से मूत्र को फ़िल्टर करती है, फेनेस्टेड एंडोथेलियम, जीबीएम और एक विशेष प्रकार के इंटरसेलुलर जंक्शन से बनी होती है जो पड़ोसी पोडोसाइट्स पैर प्रक्रियाओं को जोड़ती है, जिसे पोडोक्टीज3 का स्लिट डायाफ्राम कहा जाता है। स्वस्थ परिस्थितियों में, एल्ब्यूमिन से बड़े प्रोटीन को उनके आकार और चार्ज4 के कारण निस्पंदन बाधा से बरकरार रखा जाता है।
साइटोस्केलेटल- या पोडोसाइट-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन, साथ ही पोडोसाइट्स सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करने वाले परिसंचारी कारक, पोडोसाइट्स प्रभाव, अलगाव या एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए जाने जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीनमेह और ग्लोमेरुलर स्केलेरोसिस होता है। विशेष रूप से, साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था, पोडोसाइट्स ध्रुवीयता में परिवर्तन या स्लिट जंक्शनों के संबंधित नुकसान के साथ पैर की प्रक्रियाओं की क्षति निर्णायकहैं। उनकी टर्मिनल विभेदित स्थिति के कारण, जीबीएम की टुकड़ी के बाद पोडोसाइट्स को शायद ही बदला जा सकता है। हालांकि, अगर पोडोसाइट्स जीबीएम से जुड़े होते हैं, तो वे अभी भी प्रभाव से उबर सकते हैं और पैर प्रक्रियाओंको 6,7,8 में सुधार कर सकते हैं। विभिन्न ग्लोमेरुलर विकारों में पोडोसाइट्स क्षति का कारण बनने वाली घटनाओं की आगे की समझ नए चिकित्सीय लक्ष्य प्रदान कर सकती है जो इन बीमारियों के लिए उपचार विकसित करने में सहायता करेंगे। पोडोसाइट्स क्षति विभिन्न ग्लोमेरुलर रोगों की एक पहचान है, जिसमें फोकल सेगमेंट ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस (एफएसजीएस), डायबिटिक नेफ्रोपैथी, न्यूनतम परिवर्तन रोग, और झिल्लीदार ग्लोमेरुलोनेफ्रोपैथी शामिल हैं, जिन्हेंइन बीमारियों के लिए पैथोलॉजिकल तंत्र और संभावित उपचार दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय पोडोसाइट्स एक्स विवो मॉडल की आवश्यकता होती है। ग्लोमेरुली के अलगाव के आधार पर शास्त्रीय प्राथमिक कोशिका संस्कृति द्वारा पोडोसाइट्स का अध्ययन किया जा सकताहै। हालांकि, सीमित प्रसार क्षमता के साथ टर्मिनल रूप से विभेदित स्थिति के कारण, अधिकांश शोधकर्ता माउस या मानव सिपोडोसाइट्स सेल लाइनों का उपयोग करते हैं जो एसवी 40 बड़े टी एंटीजन के तापमान-संवेदनशील वेरिएंट को व्यक्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, सिपोडोसाइट्स को ट्रांसजेनिक चूहों से अलग किया जाता है जो एसवी 40 टैग अमर जीन 1,12 को परेशान करते हैं।
सिपोडोसाइट्स 33 डिग्री सेल्सियस पर प्रसार करते हैं, लेकिन विकास गिरफ्तारी में प्रवेश करते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस13,14 पर अंतर करना शुरू करते हैं। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इन कोशिकाओं के साथ प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या कुछ सावधानी के साथ की जानी चाहिए, क्योंकि कोशिकाएं अप्राकृतिक जीन सम्मिलन15 का उपयोग करके उत्पन्न होती हैं। चूंकि ये कोशिकाएं एक अमर जीन को आश्रय देती हैं, इसलिए चल रहे प्रसार12 के कारण सेलुलर फिजियोलॉजी बदल जाती है। इस दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न पोडोसाइट्स सेल लाइनों पर हाल ही में सवाल उठाया गया है, क्योंकि माउस, मानव और चूहा सिपोडोसाइट्स प्रोटीन स्तर पर 5% से कम सिनैप्टोपोडिन और नेफ्रिन व्यक्त करते हैं, साथ ही ग्लोमेरुलर अभिव्यक्ति16 की तुलना में एमआरएनए स्तर पर एनपीएचएस 1 और एनपीएचएस 2। इसके अलावा, अधिकांश पोडोसाइट्स सेल लाइनें नेफ्रिन17,18 को व्यक्त नहीं करती हैं। चिट्टीप्रोल एट अल ने कोशिका गतिशीलता और सिपोडोसाइट्स16 में प्यूरोमाइसिन और डॉक्सोर्यूबिसिन की प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण अंतर का भी वर्णन किया। पोडोसाइट्स विभिन्न ग्लोमेरुलर रोगों19,20,21,22 में जीबीएम से अलगाव के बाद मूत्र में पाए जा सकते हैं। व्यवहार्य मूत्र पोडोसाइट्स की खेती 2-3 सप्ताह तक की जा सकती है, लेकिन अधिकांश कोशिकाएं एपोप्टोसिस23,24 से गुजरती हैं। दिलचस्प बात यह है कि पोडोसाइट्स न केवल ग्लोमेरुलर रोग वाले रोगियों के मूत्र में पाए जाते हैं, बल्कि स्वस्थ लोगों के मूत्र में भी पाए जाते हैं, सबसे अधिक संभावना है जबवे संस्कृति में प्रतिकृति की सीमित क्षमता के साथ फिर से संवेदनशील होते हैं। इसके अलावा, मूत्र-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स संख्या सीमित है, और कोशिकाएं संस्कृति में अंतर करती हैं, कम पैर प्रक्रियाएं दिखाती हैं, आकृति विज्ञान बदलती हैं, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि सीमित प्रसार क्षमता है। पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति अनुपस्थित है, कुछ हफ्तों के भीतर गायब हो जाती है, या इन सेल क्लोनों के बीच भिन्न होती है। पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्कर के लिए सकारात्मक कुछ कोशिकाओं ने ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं या मायोफाइब्रोब्लास्ट और मेसांगियल कोशिकाओं के मार्कर को सह-व्यक्त किया, जो सुसंस्कृत मूत्र पोडोसाइट्स24,25 के डिडिफरेंटेशन और / या ट्रांसडिफरेंटेशन का सुझाव देता है।
हाल ही में, थर्मो-संवेदनशील एसवी 40 बड़े टी एंटीजन और एचटीआरटी के साथ पारगमन द्वारा रोगियों और स्वस्थ स्वयंसेवकों के मूत्र से प्राप्त सिपोडोसाइट्स सेल लाइनों की पीढ़ीका वर्णन किया गया है। सिनैप्टोपोडिन, नेस्टिन, और सीडी 2 से जुड़े प्रोटीन के लिए एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, लेकिन सभी क्लोनों में पोडोसिन एमआरएनए अनुपस्थित था। मूत्र पोडोसाइट्स के साथ समस्याओं के अलावा, इन कोशिकाओं में सम्मिलित अमर जीन भी होता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊपर चर्चा की गई हानि होती है।
इसके विपरीत, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HIPSC) में उपयुक्त परिस्थितियों में कई सेल प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करने की एक बड़ी क्षमता होती है। यह पहले दिखाया गया है कि HIPSC पोडोसाइट्स27,28 के लगभग असीमित स्रोत के रूप में काम कर सकते हैं।
यहां, त्वचा पंच बायोप्सी के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक दो-चरण यी प्रोटोकॉल बाद में एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के साथ एचआईपीएससी में और एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में अंतिम भेदभाव का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)।
चित्रा 1: रोगी-विशिष्ट हाईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल। “एचआईपीएससी में पुन: प्रोग्रामिंग और पोडोसाइट्स में भेदभाव करके त्वचा बायोप्सी के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का ग्राफिकल अवलोकन”। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पहले चरण के रूप में, दैहिक त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट ्स को त्वचा पंच बायोप्सी से बाहर निकाला गया और प्रतिलेखन कारकों OCT3/4, KLF4, SOX2 और c-MYC 29,30,31 को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एकीकरण-मुक्त विधि का उपयोग करके HIPSC में पुन: प्रोग्राम किया गया। बाद में उत्पन्न होने वाली एचआईपीएस कॉलोनियों का चयन और विस्तार किया गया। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण द्वारा मेसोडर्मल वंश के प्रेरण के साथ भेदभाव शुरू हुआ, इसके बाद नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं की पीढ़ी हुई जो अभी भी प्रसार करने में सक्षम थे। अंत में, कोशिकाओं को पोडोसाइट्स में विभेदित किया गया था। इस प्रक्रिया में, हमने बैंग एट अल.32 और ओकिता एट अल.33 द्वारा एचपीएससी की पीढ़ी के लिए एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को संशोधित और संयोजित किया, साथ ही मुसाह एट अल.28,34,35 द्वारा पोडोसाइट्स में एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल।
दरअसल, हमारे प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न पोडोसाइट्स में विवो में पोडोसाइट्स के करीब एक फेनोटाइप था, प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं के एक अलग नेटवर्क के विकास और पोडोसाइट्स-विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के बारे में, जैसे सिनैप्टोपोडिन, पोडोसिन और नेफ्रिन। एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स के उपयोग के साथ, रोगी की आनुवंशिक पृष्ठभूमि को रीप्रोग्रामिंग और भेदभाव के दौरान बनाए रखा जाता है। यह रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स रोग मॉडलिंग और लगभग असीमित सेल संख्या में संभावित चिकित्सीय पदार्थों की खोज को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल न्यूनतम आक्रामक, लागत-कुशल, नैतिक रूप से स्वीकार्य है और दवा के विकास के लिए नए रास्ते की सुविधा प्रदान कर सकता है।
यह सेल संस्कृति-आधारित प्रोटोकॉल मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग को रोगी-विशिष्ट एचपीएससी में जोड़ता है और बाद में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स में भेदभाव करता है। यह हमें पोडोसाइट्स चोट के संबंध में आनुवंशिक ग्लोमेरुलर रोग वाले रोगियों से पोडोसाइट्स के उत्परिवर्तन से संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा एकीकरण-मुक्त विधि के साथ त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट को पुन: प्रोग्राम करने का प्रोटोकॉल बैंग एट अल.32 और ओकिता एट अल.33 के प्रकाशित काम से अनुकूलित है। HIPSC से पोडोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल को Musah et al.28,34,35 से प्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है। पहले से ही एचआईपीएस 27,34,35 से पोडोसाइट्स की पीढ़ी का वर्णन करने वाले प्रकाशन उपलब्ध हैं। हालांकि, यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल पोडोसाइट्स में एचआईपीएससी के भेदभाव के बारे में अनुकूलित और कम खर्चीला है। मुसाह एट अल से प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में, हमने इस प्रोटोकॉल का परीक्षण विभिन्न कोटिंग अभिकर्मकों, जैसे विट्रोनेक्टिन, लैमिनिन सिल्क -511, और घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर किया। विट्रोनेक्टिन और लेमिनिन सिल्क -511 की सांद्रता को 5 μg / mL 28,34,35 के बजाय 2.5 μg / mL तक कम किया जा सकता है। इसके अलावा, बीएमपी 7 और एक्टिविन ए -दो बहुत महंगे विकास कारकों की सांद्रता को 50% तक कम करना संभव था- 100 एनजी / एमएल से 50 एनजी / एमएल तक।
यह कम खर्चीले भेदभाव को सक्षम बनाता है। 7 वें दिन से नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं अभी भी बढ़ रही थीं, और ठंड की संभावना पहले दिखाई गई थी। हमने पिघलने के बाद और कई दिनों तक डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) और बी 27 युक्त मूल माध्यम में अंतिम भेदभाव से पहले इन कोशिकाओं का विस्तार किया, जिससे लागत और भी कम हो गई। भेदभाव चरणों के अलावा, यह प्रोटोकॉल एपिसोमल रीप्रोग्रामिंग के माध्यम से रोगी-विशिष्ट एचपीएससी की बाद की पीढ़ी के साथ त्वचा बायोप्सी से फाइब्रोब्लास्ट ्स के आउटग्रोथ का वर्णन करता है। इन दो विधियों का संयोजन रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स की पीढ़ी को सक्षम बनाता है। इसलिए, रोगी-विशिष्ट एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक पूर्ण चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल यहां प्रदान किया गया है जिसे पहले इतने विस्तार से वर्णित नहीं किया गया था।
जैसा कि समग्र प्रोटोकॉल में कई अलग-अलग सेल प्रकार शामिल हैं, विभिन्न चरणों में उत्पन्न सेल प्रकारों को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाएं एक विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में हैं, इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण विभिन्न मार्गों पर किया जाना चाहिए। HIPSC के साथ काम करते समय, दैनिक भोजन के साथ-साथ सेल व्यवहार और आकृति विज्ञान की निगरानी आवश्यक है। 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर नसबंदी द्वारा भेदभाव मीडिया की बाँझपन सुनिश्चित किया जाना चाहिए। त्वचा बायोप्सी से लेकर एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स तक पूरे प्रोटोकॉल में कई महीने लगते हैं, लेकिन प्रक्रिया के अलग-अलग चरणों में कोशिकाओं को फ्रीज करना संभव है। फाइब्रोब्लास्ट्स, चयनित एचपीएससी क्लोन, और प्रोलिफेरेटिव नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाएं नेफ्रॉन पूर्वज भेदभाव माध्यम में 7 दिनों के बाद जमे हुए हो सकते हैं, और एक कामकाजी सेल बैंक उत्पन्न किया जा सकता है।
भले ही एचआईपीएस-व्युत्पन्न स्वस्थ पोडोसाइट्स प्राथमिक और माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं (चित्रा 5 ए, बी) का एक अलग नेटवर्क विकसित करते हैं और विशिष्ट पोडोसाइट-विशिष्ट मार्कर (चित्रा 6 ए-सी) व्यक्त करते हैं, विशिष्ट स्लिट डायाफ्राम, जैसा कि विवो में देखा गया है, शास्त्रीय दो-आयामी सेल संस्कृति मॉडल में नकल करना मुश्किल है। इसके अलावा, इस मोनो-कल्चर सेटिंग में अन्य ग्लोमेरुलर सेल प्रकारों के साथ इंटरसेल संचार संभव नहीं है।
उनके टर्मिनल विभेदित स्थिति और प्रसार क्षमता की कमी के कारण, पोडोसाइट्स एक्स विवो का अध्ययन करना मुश्किल है। सशर्त रूप से अमर प्राथमिक पोडोसाइट्स की मदद से, थर्मोसेंसिटिव स्विच के सम्मिलन द्वारा इस सीमा को दूर करना संभव है, जिसके परिणामस्वरूप एक सेल कल्चर मॉडल होता है जहां कोशिकाएं 33 डिग्री सेल्सियस पर प्रसार करती हैं और 37 डिग्री सेल्सियस13,14 पर अंतर करती हैं। यद्यपि इन सिपोडोसाइट्स में पोडोसाइट्स अनुसंधान के लिए उच्च क्षमता है, लेकिन सीमाएं हैं, जैसे मार्कर अभिव्यक्ति की कमी, विभेदित आकृति विज्ञान, और पैर प्रक्रियाओं को बनाने में विफलता15,16।
रोगी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं से पोडोसाइट्स का भेदभाव स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं के साथ रोगग्रस्त पोडोसाइट्स की पीढ़ी और तुलना को सक्षम बनाता है। यह हमें पोडोसाइट्स-विशिष्ट जीन में उत्परिवर्तन के कारण पोडोसाइट्स क्षति का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, HIPSC के साथ काम करने से त्रि-आयामी सेल कल्चर रोग मॉडल, या बल्कि ऑर्गेनोइड्स43,44 बनाने की क्षमता है। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं या मेसांगियल कोशिकाओं जैसे अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं के साथ एचआईपीएस-व्युत्पन्न पोडोसाइट्स की सह-संस्कृति, स्वास्थ्य और ग्लोमेरुलर रोग में इंटरसेल संचार के बारे में नई अंतर्दृष्टि पैदा कर सकती है।
इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट पोडोसाइट्स के लक्षण वर्णन और उपचार को उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण में पूर्व विवो किया जा सकता है। व्यक्तिगत दृष्टिकोण विशिष्ट उत्परिवर्तन के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की जांच करने और भविष्य में व्यक्तिगत चिकित्सा करने का अवसर खोलता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को फ्रेडरिक-अलेक्जेंडर विश्वविद्यालय एर्लांगेन-नुर्नबर्ग के इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लिनिकल रिसर्च (आईजेडकेएफ) द्वारा जेनिना मुलर-डेली को दिए गए अनुदान संख्या एम 4-आईजेडकेएफ-एफ 009 के साथ वित्त पोषित किया गया था, और बुंडेसमिनिस्टरियम फर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग (बीएमबीएफ) द्वारा परियोजना नाम के तहत स्टॉप-एफएसजीएस-स्पीड ट्रांसलेशन-ओरिएंटेड प्रोग्रेस टू ट्रीट एफएसजीएस, अनुदान संख्या 01जीएम 2202 डी को दिया गया था। हम एसईएम छवियों को लेने में समर्थन के लिए एनालेना क्रॉस को धन्यवाद देते हैं।
0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
sterile water | Roth | T1432 | |
syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
Primary antibodies | |||
OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
Secondary antibodies | |||
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |