本文提出了在受控实验室条件下使用人工饮食饲养卷心菜白蝴蝶的详细方案,该方案允许精确操作生命早期营养和毒素暴露。代表性结果表明如何使用该方案测定重金属毒性。
白菜白蝴蝶(Pieris rapae)是应用害虫防治研究和行为与营养生态学基础研究的重要系统。卷心菜白可以很容易地在受控条件下人工饲养,使它们成为蝴蝶世界的模式生物。在本文中,使用重金属暴露的操纵来说明饲养该物种的基本方法。一般方案说明了如何在田间捕获蝴蝶,诱导蝴蝶在温室笼子中产卵,并作为幼虫转移到人工饲料中。这些方法展示了如何标记、测量和研究蝴蝶的各种研究问题。代表性结果给出了如何使用成分不同的人工日粮来评估相对于对照日粮的蝴蝶性能的想法。更具体地说,蝴蝶对镍的耐受性最高,对铜的耐受性最差,锌的耐受性介于两者之间。讨论了这些结果的可能解释,包括一些芥末寄主植物中的镍过度积累,以及昆虫中最近的证据表明铜可能比以前认识到的毒性更大。最后,讨论首先回顾了协议的变化和对这些方法进行故障排除的方向,然后考虑未来的研究如何进一步优化本研究中使用的人工饮食。总体而言,通过提供人工饮食中卷心菜白的饲养和测量的详细视频概述,该协议为在广泛的研究中使用该系统提供了资源。
小卷心菜白蝴蝶(Pieris rapae,以下简称“白菜”)是芥菜作物的一种世界性害虫,如卷心菜、西兰花和油菜 1,2,3。同时,卷心菜白是生物学研究的强大系统,也是常用的蝴蝶模型,因为它们可以在受控实验室实验中轻松饲养和操纵4,5。对白菜白蝴蝶的研究为宿主搜索6,7,8,花蜜资源利用9,10,11,配偶选择和性选择12,13,14,翅膀模式发育和进化15,16,17以及对新颖和变化的反应提供了重要的见解。环境18,19.其中许多见解依赖于这样一个事实,即卷心菜白可以通过人工饮食4,20,21饲养,这可以精确地操纵以反映不良的营养条件22,23,生态相关的污染物水平24,25,26,27,或向新型寄主植物的过渡28,29.本研究使用重金属暴露实验来说明在实验室中人工饮食饲养卷心菜白蝴蝶的基本方法以及幼虫和成虫的关键性能指标。这些方法的许多方面适用于可以通过人工饲料饲养的其他蝴蝶30,31和飞蛾32,33,34。
本文通过金属耐受性实验来说明白菜白蝴蝶的饲养方法。重金属是一种常见的人为污染物,源于人类产品、工业过程的降解以及历史上在杀虫剂、油漆和其他产品中使用的遗留污染35,36,37,38。许多重金属,包括铅、铜、锌和镍,可以从土壤和水中移动到植物组织中39,40,41,42,灰尘中的金属可以沉积在植物叶子上43,44,45,导致多种途径暴露于植物噬虫幼虫。生命早期的重金属暴露会对动物发育产生负面影响,尤其是对神经组织,高水平可致死35,36,46,47,48。许多研究表明,金属暴露对发育中的昆虫(包括害虫和益虫)的负面影响49,50,51。大量的重金属污染物,以及它们经常在人类环境中同时发生的事实52,意味着需要精确的实验室方法,研究人员可以将发育中的昆虫暴露于不同水平和不同金属的组合中,以了解和减轻其对环境的影响。
本工作对比了常见金属对卷心菜白生存和发育的影响,重点关注铜(Cu),锌(Zn)和镍(Ni),这是人类环境中的三种常见污染物。例如,来自明尼苏达州农村路边的杂草含有高达 71 ppm 的锌、28 ppm 的铜和 5 ppm 的镍53。该实验操纵卷心菜白蝴蝶人工饮食中这些金属的含量,其水平与环境中看到的水平相对应并超过。人工饮食用于对比这些金属的相对毒性,预测卷心菜白对金属污染物更敏感,这些金属污染物不是其生理学(镍)的组成部分,相对于酶和组织(铜和锌; 图1)。自始至终,本文提供了方法细节和随附的视频可视化,以说明这一重要蝴蝶模型系统的饲养和研究方法。
在这项研究中,卷心菜白蝴蝶(Pieris rapae)在人工饮食中饲养,以检查重金属毒性的差异。在此过程中,本研究为这种易于操作的蝴蝶系统的饲养和实验室研究提供了一般方法。本次讨论首先考虑了有关此处所审查的方法的更一般的问题,然后回顾了我们的科学发现,然后对人工饮食的组成部分进行了反思。
这里回顾的协议给出了卷心菜白蝴蝶的一般饲养方法的步骤,但该协议中有许多要点可以调整。例如,虽然这里介绍的案例研究使用海绵进行喂养,但其他研究人员很幸运地使用牙芯和装满蜂蜜水的绢花5。虽然本研究使用蜂蜜水作为食物,但其他研究人员使用了糖溶液甚至佳得乐。如果需要称量蛹,或移动到其他条件以出苗(例如,诱导滞育和需要冷藏1个月),研究人员可以轻松地将它们从杯子中取出,方法是用水喷洒以润湿它们的丝绸附件并用羽毛钳抓住它们,然后使用双面胶带重新悬挂它们。如果研究人员在成年蝴蝶何时被移入笼子以进行成年行为方面需要更大的灵活性,它们可以在冰箱中放置数周,但需要喂食。每隔几天,应将蝴蝶取出喂入稀释的蜂蜜水溶液。在室内照明下,这可以通过使用别针将它们的长鼻展开到食物中来完成。在成人表演端,可以对卷心菜白蝴蝶采取广泛的健身措施。体型可以测量为幼虫在某些阶段、蛹或成虫(处死或保存在玻璃信封中)的湿质量或干质量,或通过在程序 ImageJ 中测量翅膀长度(见 12,24,25,28)。雌性的终生繁殖力可以通过寄主植物25,69,70的每日取卵来衡量,特定性状的大小可以作为性能的指标来衡量;例如,大脑或单个大脑区域的质量或体积62,71,72,或胸部或飞行肌肉的质量或蛋白质含量62,70。最后,成年人可用于行为研究,以测试任意数量的问题,以检查饮食操纵对觅食或产卵选择的影响27,73。
如果饲养协议未按预期工作,则有几个方面需要排除故障。首先,人们可以问光线水平是否足够高,以引发正常的成人行为。虽然实验室适应的Pieris系列将在荧光灯下产卵,但唯一适用于野生型系的人造光是强大的广谱温室灯。温室、窗台或户外的自然光最能引发交配和产卵行为。其次,如果卵没有孵化,或者幼虫在发育早期死亡,需要考虑一些事情。寄主植物材料必须是有机的,请注意,商店中的“有机”植物有时会用可以杀死幼虫的化学物质进行处理,因此饲养自己的寄主植物通常是最好的。如果宿主接受率较低,则可以尝试氮含量较高的年轻叶子,呈现盆栽植物而不是单个叶子,并确保雌配。雌性将接受播种芸苔属植物,即使是 2 周龄的小芽。石蜡法可以很好地将鸡蛋转移到不同的条件下,但应该注意的是,接受率往往低于整株植物。第三,饮食的所有成分必须是高质量的,没有过期。亚麻籽油应每年更换并存放在冰箱24,25中。小麦胚芽、维生素混合物和抗生素也应保持凉爽。第四,可以考虑调整减肥杯的设置。可以使用任意数量的一次性塑料杯类型进行饲养,从 1 盎司到 15 盎司不等。我们发现 4 盎司的尺寸很好,可以容纳成虫出现,并且可以很好地装入我们的气候室。盖子上戳的孔允许气流,但在低湿度条件下,太多的孔会使饮食干燥,因此可能需要调整此数字。第五,气候室中的条件可能需要结合杯子条件进行调整。如果条件太干燥,有卵的寄主植物可能会在幼虫转移之前变干,而有饮食的杯子可能会在蝴蝶出现之前变干。另一方面,如果条件太湿,杯子可能会发霉和生病。研究人员可能需要通过使用网状盖子或盖子上或多或少的孔来调节杯子中的气流。另一个常见问题是腔室灯足够亮,会导致杯子温度波动和冷凝积聚;使用调光灯是幼虫饲养的简单选择。
关于本文的研究问题,本研究发现卷心菜白对铜的敏感度高于镍或锌。铜对浓度低至50 ppm(图3和表3)的开发时间和500 ppm时的存活率(图4,表4)有显著的负面影响。相比之下,镍对生存没有负面影响(高达500 ppm;图3)或在 100 ppm 时对显影时间产生负面影响(图 4)。卷心菜白对锌的耐受性相当强,仅在 1,000 ppm 时观察到生存效果(图 3),从 100 ppm 开始对开发时间产生负面影响(图 4)。基于蝴蝶组织和芥末(它们的寄主植物;图1),预计对锌的耐受性相对较高。然而,鉴于蝴蝶组织中镍的含量非常低(图1)以及铜作为微量营养素的必要性,对铜的敏感性和对镍的耐受性有些出乎意料。在考虑了这些金属在其他蝴蝶和飞蛾中的耐受性后,下面将讨论这些意想不到的发现。
为了将现有数据与其他鳞翅目中测量的金属敏感性进行比较,汇编了现有研究的数据,其中重金属对生存产生负面影响 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68;这些研究的重点是飞蛾,特别是害虫物种(Galleria mellonella,Lymantria dispar,Plutella xylostella,Spodoptera sp.)。本研究中所有测量的灵敏度值都接近这些其他物种的测量范围(图5)。然而,这项研究中镍耐受性的测量值似乎确实高于预期 – 虽然在500 ppm下没有显着的生存影响,但之前对Pieris rapae的研究也发现对镍的耐受性非常高(显着影响从1,000 ppm56开始),尽管它们组织中的自然水平较低(图1).这项研究中铜敏感性的测量似乎也处于鳞翅目研究的低端。虽然使用人工饮食可以方便和受控地比较相对金属灵敏度,但重要的是要注意,饮食的成分可能会改变绝对金属灵敏度的测量。例如,饮食中的维生素C可以抵消金属诱导的氧化应激74,或者饮食中的抗生素可以改变微生物对金属加工的任何影响75。未来一个有趣的研究方向是系统地操纵这些饮食成分来测试对金属毒性的影响,特别是考虑到关于鳞翅目肠道微生物76,77和可能具有抗氧化特性的花蜜成分的功能作用的问题78。此外,不同物种饮食需求的差异可能使种间比较具有挑战性,基于人工饮食的方法应辅以对寄主植物的操纵。
这些蝴蝶对镍特别耐受,对铜敏感。先前的研究已经注意到,芥菜科中的许多植物,包括受Pieridae青睐的植物,过度积累镍作为对食草动物55,56,63,79,80,81的防御机制。这种超积累在植物组织中超过1,000 ppm,比大多数植物中所看到的要大几个数量级(图1)。正如之前推测的那样,由于过去选择的此类镍蓄能器,Pieris可能对镍具有特别高的耐受性26。虽然铜作为昆虫饮食中的微量营养素研究较少,但有一些证据表明它在繁殖和免疫中起的作用很小,尽管主要在吸血昆虫中(例如,82,83)。铜在蝴蝶中的生理作用可能不如其他动物重要84,85,86,这与最近的工作一致,强调铜如何与铅,镉和汞等昆虫污染物有关(例如,87,88,89)。虽然Pieris已被证明可以避免低水平90的铜污染,但铜在植物中的流动性(例如,移动到叶子和花朵中)也将其标记为值得关注的金属污染物91。
虽然这些结果提供了有关这些金属对卷心菜白蝴蝶相对毒性的有趣数据,但本文还旨在作为饲养这种强大系统的方法的详细视觉说明。卷心菜白易于饲养和操纵在受控实验室实验4,5中有助于宿主搜索6,7,8,觅食9,10,11和性选择12,13,14的研究。以人工饮食饲养这些蝴蝶的能力是创造共同花园条件进行比较和操纵营养物质、毒素甚至新型寄主植物的关键。然而,重要的是要注意,这种人工饮食不一定是该物种的最佳人工饮食,并且可能会通过未来的操作得到改善。例如,这种饮食(和其他鳞翅目动物饮食)中的盐混合物最初是为脊椎动物开发的,其钙含量高于大多数昆虫所需的钙水平92,93。因此,我们的一些饲养工作已经制作了钙含量较低的定制盐混合物(例如,62),而另一些则使用“贝克盐混合物”,这可能更适合许多昆虫物种94。在我们自己的操作中,我们还发现,与原始浓度相比,蝴蝶在相对较少的小麦胚芽和相对更多的纤维素下表现更好4。需要进一步关注的一个领域是饮食中的脂质来源和浓度。例如,过去的研究表明,从亚麻籽油(用于本研究)转向磷脂会增加人工日粮中Pieris的交配率和生长速率95。在人工饮食中补充特定脂肪酸可能会产生额外的积极影响96,97。优化Pieris98,99的人工饮食为解决有关营养生态学100,101,102,进化生态学和生态毒理学的有趣问题创造了机会。这些人工饮食方法使研究人员能够解决有关特定脂质在认知进化103,毒素预适应28,降低污染物毒性的饮食成分104或营养素之间的化学计量相互作用105中的作用的问题。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢本科生助理在抚养这项工作期间的支持,特别是Regina Kurandina和Rhea Smykalski。Carolyn Kalinowski帮助汇编了有关其他鳞翅目金属毒性的文献。这项工作是由明尼苏达大学生态,进化和行为系暑期研究资助的。
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