Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för uppfödning av kålvit fjäril i kontrollerade laboratorieförhållanden med en konstgjord diet, vilket möjliggör exakta manipuleringar av näring och toxinexponering i tidigt liv. De representativa resultaten visar hur tungmetalltoxicitet kan analyseras med detta protokoll.
Den vitkålsfjärilen (Pieris rapae) är ett viktigt system för tillämpad skadedjursbekämpningsforskning och grundforskning inom beteende- och näringsekologi. Kålvita kan lätt födas upp under kontrollerade förhållanden på en konstgjord diet, vilket gör dem till en modellorganism i fjärilsvärlden. I denna uppsats används en manipulation av tungmetallexponering för att illustrera grundläggande metoder för uppfödning av denna art. Det allmänna protokollet illustrerar hur fjärilar kan fångas i fältet, induceras att lägga ägg i växthusburar och överföras som larver till konstgjorda dieter. Metoderna visar hur fjärilar kan märkas, mätas och studeras för en rad olika forskningsfrågor. De representativa resultaten ger en uppfattning om hur artificiella dieter som varierar i komponenter kan användas för att bedöma fjärilsprestanda i förhållande till en kontrolldiet. Mer specifikt var fjärilar mest toleranta mot nickel och minst toleranta mot koppar, med en tolerans av zink någonstans i mitten. Möjliga förklaringar till dessa resultat diskuteras, inklusive nickelhyperackumulering i vissa senapsvärdväxter och nya bevis hos insekter att koppar kan vara giftigare än tidigare uppskattat. Slutligen granskar diskussionen först variationer i protokollet och anvisningar för felsökning av dessa metoder innan man överväger hur framtida forskning ytterligare kan optimera den konstgjorda kosten som används i denna studie. Sammantaget, genom att ge en detaljerad videoöversikt över uppfödning och mätning av kålvita på konstgjorda dieter, ger detta protokoll en resurs för att använda detta system inom ett brett spektrum av studier.
Den lilla kålvita fjärilen (Pieris rapae, nedan “kålvit”) är en kosmopolitisk skadedjur av senapsgrödor, såsom kål, broccoli och raps 1,2,3. Samtidigt är kålvita ett kraftfullt system för forskning inom biologi och en vanlig fjärilsmodell, eftersom de lätt kan födas upp och manipuleras i kontrollerade laboratorieexperiment 4,5. Forskning om kålvita fjärilar har gett kritiska insikter med avseende på värdsökning 6,7,8, nektarresursanvändning 9,10,11, kompisval och sexuellt urval 12,13,14, vingmönsterutveckling och evolution15,16,17 och svar på nya och föränderliga miljöer18,19. Många av dessa insikter bygger på det faktum att kålvita kan födas upp på konstgjorda dieter 4,20,21, vilket kan manipuleras exakt för att återspegla dåliga näringsförhållanden 22,23, ekologiskt relevanta föroreningsnivåer 24,25,26,27 eller övergångar till nya värdväxter28,29. Den aktuella studien använder ett experiment om exponering för tungmetaller för att illustrera grundläggande metoder för uppfödning av kålvita fjärilar på en konstgjord diet i laboratoriet och nyckeltal för larver och vuxna. Många aspekter av dessa metoder gäller för andra fjärilar30,31 och malar32,33,34 som kan födas upp på en konstgjord diet.
I detta dokument används ett experiment på metalltolerans för att illustrera de allmänna metoderna för uppfödning av kålvita fjärilar. Tungmetaller är en vanlig antropogen förorening som härrör från nedbrytning av mänskliga produkter, industriella processer och äldre föroreningar från historisk användning i bekämpningsmedel, färger och andra produkter35,36,37,38. Många tungmetaller, inklusive bly, koppar, zink och nickel, kan flytta från jord och vatten till växtvävnad 39,40,41,42, och metaller i damm kan deponeras på växtblad43,44,45, vilket resulterar i flera exponeringsvägar för fytofagösa insektslarver. Tungmetallexponering tidigt i livet kan ha negativa effekter på djurens utveckling, särskilt på nervvävnad, och höga nivåer kan vara dödliga 35,36,46,47,48. Ett antal studier har visat de negativa effekterna av metallexponering på utvecklande insekter, inklusive både skadedjur och nyttiga insekter 49,50,51. Det stora antalet tungmetallföroreningar, och det faktum att de ofta förekommer samtidigt i mänskliga miljöer52, innebär att exakta laboratoriemetoder behövs där forskare kan exponera utvecklande insekter för olika nivåer och kombinationer av olika metaller för att förstå och mildra deras miljöpåverkan.
Det aktuella arbetet kontrasterar effekterna av vanliga metaller på kålvit överlevnad och utveckling, med fokus på koppar (Cu), zink (Zn) och nickel (Ni), tre vanliga föroreningar i mänskliga miljöer. Till exempel innehåller forbs från landsbygden i Minnesota vägar upp till 71 ppm Zn, 28 ppm Cu och 5 ppm Ni53. Detta experiment manipulerar nivåerna av dessa metaller i konstgjorda dieter av kålvita fjärilar på nivåer som motsvarar och överskrider de nivåer som ses i miljön. En konstgjord diet används för att kontrastera den relativa toxiciteten hos dessa metaller och förutsäga att kålvita skulle vara mer känsliga för metallföroreningar som inte är en integrerad del av deras fysiologi (nickel) i förhållande till de som förekommer, om än i små nivåer, i enzymer och vävnader (koppar och zink; Figur 1). Genomgående ger denna text metodologiska detaljer och medföljande videovisualiseringar för att illustrera uppfödnings- och forskningsmetoderna för detta viktiga fjärilsmodellsystem.
I denna forskning höjdes kålvita fjärilar (Pieris rapae) på en konstgjord diet för att undersöka skillnader i tungmetalltoxicitet. På så sätt ger denna studie allmänna metoder för uppfödning och laboratoriestudier av detta lättmanipulerade fjärilssystem. Denna diskussion behandlar först mer allmänna frågor om de metoder som granskas här, sedan granskar våra vetenskapliga resultat innan de avslutas med reflektioner om komponenterna i den konstgjorda kosten.
Protokollet som granskas här ger steg i en allmän uppfödningsmetod för kålvita fjärilar, men det finns många punkter inom detta protokoll som kan justeras. Till exempel, medan fallstudien som presenteras här använder svampar för utfodring, har andra forskare haft tur med tandvekar och silkeblommor fyllda med honungsvatten5. Medan den aktuella studien använder honungsvatten som mat har andra forskare använt sockerlösningar och till och med Gatorade. Om puppor behöver vägas eller flyttas till andra förhållanden för uppkomst (t.ex. inducerande diapaus och behov av kylförvaring i 1 månad) kan forskaren enkelt ta bort dem från kopparna genom att spruta dem med vatten för att fukta sina silkefästen och ta tag i dem med fjäderpincett och sedan hänga dem igen med dubbelhäftande tejp. Om forskare behöver mer flexibilitet när det gäller när vuxna fjärilar flyttas in i burar för vuxenbeteende, kan de hållas i kylskåpet i flera veckor, men de måste matas. Varje dag ska fjärilarna tas ut för att matas med en utspädd honungsvattenlösning. Under inomhusbelysning kan detta göras genom att använda en stift för att rulla ut sin proboscis i maten. I slutet av vuxenprestationen kan ett brett utbud av träningsåtgärder vidtas på kålvita fjärilar. Kroppsstorlek kan mätas som den våta eller torra massan av larver i vissa stadier, puppor eller vuxna (offrade eller hållna i glasinhöljen), eller genom mätning av vinglängd i programmet ImageJ (se 12,24,25,28). Honornas livstidsfruktsamhet kan mätas genom dagliga äggsamlingar på värdväxter 25,69,70, och storleken på specifika egenskaper kan mätas som ett mått på prestanda; Till exempel massan eller volymen i hjärnan eller enskilda hjärnregioner 62,71,72, eller massan eller proteininnehållet i bröstkorgen eller flygmuskeln 62,70. Slutligen kan vuxna användas i beteendestudier för att testa ett antal frågor som undersöker effekten av dietmanipulation på födosök eller ovipositionsval27,73.
Om uppfödningsprotokollet inte fungerar som förväntat finns det några aspekter att felsöka. Först kan man fråga sig om ljusnivåerna är tillräckligt höga för att framkalla normalt vuxenbeteende. Medan laboratorieanpassade linjer av Pieris kommer att lägga ägg under fluorescerande ljus, är det enda konstgjorda ljuset som fungerar för vildtypslinjer kraftfulla bredspektrum växthusljus. Naturligt ljus i växthus, fönsterbrädor eller utomhus fungerar bäst för att framkalla parning och äggläggningsbeteende. För det andra, om ägg inte kläcks eller om larver dör tidigt i utvecklingen, finns det några saker att tänka på. Värdväxtmaterialet måste vara organiskt och notera att “organiska” växter från butiker ibland behandlas med kemikalier som kan döda larver, så att höja sina egna värdväxter är ofta bäst. Om värdens acceptans är lägre kan yngre blad med högre kvävehalt försökas, presentera krukväxter istället för enskilda blad och se till att honor paras. Kvinnor accepterar sådd Brassica, även små groddar som är 2 veckors ålder. Paraffinmetoden fungerar bra för att överföra ägg till olika förhållanden, men det bör noteras att acceptansgraden tenderar att vara lägre än hela växter. För det tredje måste alla komponenter i kosten vara av hög kvalitet och inte löpt ut. Linfröolja bör bytas ut årligen och förvaras i kylen24,25. Vetegroddar, vitaminblandningen och antibiotika bör också hållas svala. För det fjärde kan man överväga att justera dietkoppinställningen. Valfritt antal engångsplastkopptyper kan användas för uppfödning, från 1 oz till 15 oz. Vi har funnit att 4 oz är en bra storlek för att möjliggöra vuxen uppkomst och packar snyggt in i våra klimatkammare. Hål i locken möjliggör luftflöde, men för många hål kan torka kosten vid låg luftfuktighet, så detta antal kan behöva justeras. För det femte kan förhållandena i klimatkammaren behöva justeras i kombination med koppförhållandena. Om förhållandena är för torra kan värdväxter med ägg torka ut innan larver kan överföras, och koppar med diet kan torka ut innan fjärilar dyker upp. Å andra sidan, om förhållandena är för våta, kan kopparna hysa mögel och sjukdom. Forskare kan behöva justera luftflödet i koppar genom att använda nätlock eller mer eller mindre hål i locken. En annan vanlig fråga är kammarlampor som är tillräckligt ljusa för att orsaka temperatursvängningar i kopparna och en uppbyggnad av kondens; Att använda dimmerljus är ett enkelt alternativ för larvuppfödning.
När det gäller forskningsfrågorna i denna uppsats fann denna studie att kålvita var relativt känsligare för koppar än för nickel eller zink. Koppar hade betydande negativa effekter på utvecklingstiden vid koncentrationer så låga som 50 ppm (figur 3 och tabell 3) och på överlevnad vid 500 ppm (figur 4, tabell 4). Däremot fanns det inga negativa effekter av nickel på överlevnad (upp till 500 ppm; Figur 3) eller negativa effekter på utvecklingstiden vid 100 ppm (figur 4). Kålvita var ganska toleranta mot zink, med överlevnadseffekter endast vid 1,000 ppm (Figur 3) och negativa effekter på utvecklingstiden som börjar vid 100 ppm (Figur 4). Baserat på de relativt större koncentrationerna av zink i fjärilsvävnad och senap (deras värdväxt; Figur 1) förväntades en relativt större tolerans mot zink ses. Känsligheten för koppar och toleransen för nickel var dock något oväntade med tanke på de mycket låga nivåerna av nickel i fjärilsvävnad (figur 1) och nödvändigheten av koppar som mikronäringsämne. Dessa oväntade fynd diskuteras nedan efter att ha beaktat toleransen för dessa metaller i andra fjärilar och malar.
För att jämföra nuvarande data med metallkänslighet uppmätt i andra Lepidoptera sammanställdes data från befintliga studier om minimikoncentrationen, där tungmetaller påverkade överlevnaden negativt 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; dessa studier fokuserade på malar, särskilt skadedjursarter (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alla uppmätta känslighetsvärden i denna studie ligger nära det intervall som uppmätts för dessa andra arter (figur 5). Måttet på nickeltolerans i denna studie verkar dock vara högre än förväntat – medan det inte fanns någon signifikant effekt av överlevnad vid 500 ppm, fann den tidigare studien på Pieris rapae också en mycket hög tolerans för nickel (signifikanta effekter som börjar vid 1,000 ppm56), trots låga nivåer i deras vävnad naturligt (Figur 1). Måttet på kopparkänslighet i denna studie verkar också vara i den låga änden för studier av Lepidoptera. Medan användningen av en konstgjord diet möjliggör en bekväm och kontrollerad jämförelse av relativ metallkänslighet är det viktigt att notera att komponenter i kosten kan förändra mätningen av absolut metallkänslighet. Till exempel kan C-vitamin i kosten kompensera metallinducerad oxidativ stress74, eller antibiotika i kosten kan förändra eventuella effekter av mikrober på bearbetning av metaller75. En intressant linje för framtida forskning skulle vara att systematiskt manipulera sådana dietkomponenter för att testa effekter på metalltoxicitet, särskilt med tanke på frågor om den funktionella rollen av lepidopteran tarmmikrober 76,77 och nektarkomponenter som kan ha antioxidantegenskaper78. Dessutom kan variationer i kostbehov mellan arter göra interspecifika jämförelser utmanande, och artificiella dietbaserade metoder bör kompletteras med manipulation av värdväxter.
Dessa fjärilar är särskilt toleranta mot nickel och känsliga för koppar. Tidigare forskning har noterat att många växter i senapsfamiljen, som inkluderar växter som gynnas av Pieridae, hyperackumulerar nickel som en defensiv mekanism mot växtätare 55,56,63,79,80,81. Denna hyperackumulering är över 1,000 ppm i växtvävnad, vilket är storleksordningar större än vad som ses i de flesta växter (figur 1). Det är möjligt att Pieris har en särskilt hög tolerans för nickel på grund av tidigare selektion av sådana nickelackumulatorer, som tidigare spekulerats26. Medan koppar har studerats mindre ofta som ett mikronäringsämne i insektsdieter, finns det vissa bevis för att det spelar en liten roll i reproduktion och immunitet, men främst hos blodmatande insekter (t.ex. 82,83). Det är möjligt att koppar spelar en mindre viktig fysiologisk roll i fjärilar än hos andra djur 84,85,86, i överensstämmelse med det senaste arbetet som belyser hur koppar kan vara lika oroande för ett förorenande ämne för insekter som bly, kadmium och kvicksilver (t.ex. 87,88,89). Medan Pieris har visat sig undvika kopparförorening vid låga nivåer90, har rörligheten för koppar i växter (t.ex. flyttar in i löv och blommor) också flaggat det som en metallförorening av oro91.
Medan dessa resultat ger intressanta data om den relativa toxiciteten hos dessa metaller för kålvita fjärilar, syftar detta dokument också till att vara av allmänt bruk som en detaljerad visuell illustration av metoder för uppfödning av detta kraftfulla system. Kålvita är lätta att baka och manipulera i kontrollerade laboratorieexperiment 4,5 underlätta studier av värdsökning 6,7,8, födosök9,10,11 och sexuellt urval12,13,14. Förmågan att föda upp dessa fjärilar på en konstgjord diet är nyckeln till att skapa gemensamma trädgårdsförhållanden för jämförelser och att manipulera näringsämnen, toxiner och till och med nya värdväxter. Det är dock viktigt att notera att denna konstgjorda diet inte nödvändigtvis är den optimala konstgjorda kosten för denna art, och kan sannolikt förbättras med framtida manipulationer. Till exempel utvecklades saltblandningen i denna diet (och andra lepidopterandieter) ursprungligen för ryggradsdjur och har högre kalciumnivåer än vad de flesta insekter behöver92,93. Således har några av våra uppfödningsinsatser gjort anpassade saltblandningar med lägre kalciumnivåer (t.ex. 62), och andra använder “Becks saltblandning”, vilket kan vara mer lämpligt för många insektsarter94. I våra egna manipulationer fann vi också att fjärilar presterade bättre med relativt mindre vetegroddar och relativt mer cellulosa jämfört med ursprungliga koncentrationer4. Ett område som behöver ytterligare uppmärksamhet är lipidkällan och koncentrationen i kosten. Till exempel har tidigare arbete visat att övergången från linolja (används i denna studie) till fosfolipider ökade parningshastigheten och tillväxthastigheten för Pieris på konstgjorda dieter95. Tillskott av specifika fettsyror i konstgjorda dieter kan ha ytterligare positiva effekter96,97. Optimering av den artificiella kosten för Pieris98,99 skapar möjligheter att ta itu med intressanta frågor om näringsekologi 100,101,102, evolutionär ekologi och ekotoxikologi. Dessa konstgjorda dietmetoder gör det möjligt för forskare att ta itu med frågor om specifika lipiders roll i kognitiv evolution 103, föranpassning till toxiner28, kostkomponenter som minskar toxiciteten hos föroreningar 104 eller stökiometriska interaktioner mellan näringsämnen105.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för stödet från assistenter under uppfödningen för detta arbete, särskilt Regina Kurandina och Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hjälpte till att sammanställa litteratur om metalltoxicitet i andra Lepidoptera. Detta arbete möjliggjordes av ett sommarforskningsbidrag från University of Minnesota Department of Ecology, Evolution and Behavior.
1-L Pyrex beaker | Fisher Scientific | 07-250-059 | |
500 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 03-007-43 | |
60-mm plastic petri dish lid | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
Ascorbic Acid | Frontier | 6015 | |
Blender | Amazon – Ninja Store | BL610 Professional | |
Cabbage Flour | Frontier | 1086 | |
Casein | Frontier | 1100 | |
Celluose | Frontier | 3425 | |
Cholsterol | Sigma | C3045 | |
Cups for rearing (4 oz) | Wasserstrom | 6094583 | purchase with matching lids |
Fine Mesh Agar | Sigma | ||
Flaxseed Oil | amazon | B004R63VI6 | |
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch | Amazon – Yimaa Direct | B08BZ969DK | |
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) | Amazon – Wizard Coin Supply | B0045FG90G | |
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") | Amazon | B07SK6P94S | |
Methyl Paraben | Frontier | 7685 | |
Ohaus Portable Scale | Fisher Scientific | 02-112-228 | |
Organic Honey | Amazon | B07DHQQFGM | |
Photo studio portable lightbox | Amazon | B07T6TNYJ1 | |
Plastic bin, shoebox size | Amazon | B09L3B3V1R | |
Plastic disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-680-50 | |
Sorbic Acid | Sigma | S1626 | |
Spatulas | Fisher Scientific | 14-357Q | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Sucrose | Target | ||
Torula Yeast | Frontier | 1720 | |
Vanderzant vitamin mix | Frontier | F8045 | |
Weigh boats | Fisher Scientific | 01-549-750 | |
Wesson Salt Mix | Frontier | F8680 | |
Wheat Germ | Frontier | G1659 | |
Wooden handled butterfly net, 12" hoop | Amazon – Educational Science | B00O5JDLVC | |
Yellow sponges | Amazon-Celox | B0B8HTHY5B |