Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren
Summary
Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.
Abstract
Met de vooruitgang van multi-fotonenmicroscopie en moleculaire technologieën, groeit fluorescentiebeeldvorming snel uit tot een krachtige benadering voor het bestuderen van de structuur, functie en plasticiteit van levende hersenweefsels. In vergelijking met conventionele elektrofysiologie kan fluorescentiemicroscopie zowel de neurale activiteit als de morfologie van de cellen vastleggen, waardoor langdurige opnames van de geïdentificeerde neuronpopulaties met een eencellige of subcellulaire resolutie mogelijk zijn. Beeldvorming met hoge resolutie vereist echter meestal een stabiele, met het hoofd gefixeerde opstelling die de beweging van het dier beperkt, en de voorbereiding van een plat oppervlak van transparant glas maakt visualisatie van neuronen op een of meer horizontale vlakken mogelijk, maar is beperkt in het bestuderen van de verticale processen die over verschillende diepten lopen. Hier beschrijven we een procedure om een hoofdplaatfixatie en een microprisma te combineren dat meerlagige en multimodale beeldvorming geeft. Dit chirurgische preparaat geeft niet alleen toegang tot de hele kolom van de visuele cortex van de muis, maar maakt ook beeldvorming met twee fotonen mogelijk in een hoofdvaste positie en beeldvorming met één foton in een vrij bewegend paradigma. Met behulp van deze benadering kan men geïdentificeerde celpopulaties in verschillende corticale lagen bemonsteren, hun reacties registreren onder hoofdvaste en vrij bewegende toestanden, en de veranderingen op lange termijn gedurende maanden volgen. Deze methode biedt dus een uitgebreide analyse van de microschakelingen, waardoor een directe vergelijking mogelijk is van neurale activiteiten die worden opgeroepen door goed gecontroleerde stimuli en onder een natuurlijk gedragsparadigma.
Introduction
De komst van in vivo twee-foton fluorescerende beeldvorming 1,2, die de nieuwe technologieën in optische systemen en genetisch gemodificeerde fluorescentie-indicatoren combineert, is naar voren gekomen als een krachtige techniek in de neurowetenschappen om de ingewikkelde structuur, functie en plasticiteit in het levende brein te onderzoeken 3,4. In het bijzonder biedt deze beeldvormingsmodaliteit een ongeëvenaard voordeel ten opzichte van traditionele elektrofysiologie door zowel de morfologie als de dynamische activiteiten van neuronen vast te leggen, waardoor het volgen van geïdentificeerde neuronen op lange termijn wordt vergemakkelijkt 5,6,7,8.
Ondanks de opmerkelijke sterke punten vereist de toepassing van fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie vaak een statische, hoofdvaste opstelling die de mobiliteit van het dier beperkt 9,10,11. Bovendien beperkt het gebruik van een transparant glazen oppervlak voor het visualiseren van neuronen de waarnemingen tot een of meer horizontale vlakken, waardoor de verkenning van de dynamiek van verticale processen die zich over verschillende corticale diepten uitstrekken, wordt beperkt.
Om deze beperkingen aan te pakken, schetst de huidige studie een innovatieve chirurgische procedure die hoofdplaatfixatie, microprisma en miniscoop integreert om een beeldvormingsmodaliteit te creëren met meerlagige en multimodale mogelijkheden. Het microprisma maakt de observatie mogelijk van de verticale verwerking langs de corticale kolom 13,14,15,16, wat van cruciaal belang is om te begrijpen hoe informatie wordt verwerkt en getransformeerd terwijl deze door verschillende lagen van de cortex beweegt en hoe de verticale verwerking wordt veranderd tijdens plastische veranderingen. Bovendien maakt het beeldvorming van dezelfde neurale populaties mogelijk in een hoofdgefixeerd paradigma en in een vrij bewegende omgeving, die de veelzijdige experimentele omgevingen omvat 17,18,19: hoofdfixatie is bijvoorbeeld vaak vereist voor goed gecontroleerde paradigma’s zoals sensorische waarnemingsbeoordeling en stabiele opnames onder het 2-fotonparadigma, terwijl vrij bewegen een meer natuurlijke, flexibele omgeving biedt voor gedragsstudies. Daarom is het vermogen om een directe vergelijking in beide modi uit te voeren cruciaal voor het vergroten van ons begrip van de microschakelingen die flexibele, functionele reacties mogelijk maken.
In wezen biedt de integratie van hoofdplaatfixatie, microprisma en miniscoop in fluorescentiebeeldvorming een veelbelovend platform voor het onderzoeken van de fijne kneepjes van de structuur en functionaliteit van de hersenen. Onderzoekers kunnen geïdentificeerde celpopulaties over verschillende diepten bemonsteren die alle corticale lagen beslaan, hun reacties direct vergelijken in zowel goed gecontroleerde als natuurlijke paradigma’s en hun langetermijnveranderingen gedurende20 maanden volgen. Deze benadering biedt waardevol inzicht in hoe deze neurale populaties op elkaar inwerken en in de loop van de tijd veranderen onder verschillende experimentele omstandigheden, en biedt een venster op de dynamische aard van neurale circuits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we het vermogen getoond om neuronen te observeren en direct te vergelijken in hoofdgefixeerde en vrij bewegende omstandigheden in dezelfde neurale populaties. Hoewel we de toepassing in de visuele cortex hebben gedemonstreerd, kan dit protocol worden aangepast aan een groot aantal andere hersengebieden, zowel corticale gebieden als diepe kernen 24,25,26,27,28, evenals andere data-acquisitie en gedragsopstellingen<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken mevrouw Charu Reddy en professor Matteo Carandini (Cortex Lab) voor hun advies over het chirurgische protocol en het delen van transgene muizenstammen. We danken Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) voor zijn begeleiding en hulp bij de ontwikkeling van de operatie. Wij danken mevrouw Andreea Aldea (Sun Lab) voor haar hulp bij de chirurgische opzet en gegevensverwerking. Dit werk werd ondersteund door de Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
