생물학적 표준을 사용한 연구의 재현성 및 조화: 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드의 예

Summary

여기에서는 광투과 응집법을 이용하여 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드 가교(CRP-XL)를 표준화하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 혈소판 기능을 목표로 하지만, 실험 과정은 과학적 엄격성과 재현성을 보장하기 위해 대부분의 생물학적 분자 및 생물학적 분석에 적용될 수 있습니다.

Abstract

측정의 과학인 도량형은 생물학자들이 훈련을 받을 때 배워지는 과목이 거의 없습니다. 간단한 표준화 프로세스를 일상적인 작업 관행에 적용하면 데이터에 대한 신뢰와 거리와 시간에 대한 재현성을 얻을 수 있습니다.

이 방법은 지혈 연구 및 임상 실습에서 널리 사용되는 핵심 실험실 실험, 특히 광 투과 응집법(LTA)에 의한 혈소판 콜라겐 수용체(당단백질[GP]VI) 작용제 콜라겐 관련 펩타이드, 가교(CRP-XL)에 대한 반응을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하면 작용제 재고 또는 공급업체에 관계없이 실험실 내 재현성과 실험실 간 조화를 보장할 수 있습니다. 중요한 것은 이 방법이 다른 혈소판 작용제와 실제로 다른 많은 생물학적 분자 및 생물학적 검정에 적용할 수 있다는 것입니다.

아래에 설명된 프로세스에는 ‘표준’ 및 ‘테스트'(확인 중인 물질)의 6-8포인트 희석 시리즈를 만들고 선택한 분석(이 경우 LTA)에서 나란히 실행하는 것이 포함됩니다. CRP-XL은 질량/부피 농도에서 사용되지만 모든 물질이 주어진 농도에서 동일한 생물학적 활성을 제공하는 것은 아니므로 희석 시리즈를 통해 표준 물질과 테스트 물질을 비교하고 동등한 활성을 제공하는 데 필요한 농도를 결정합니다. 희석 계열은 0-100% 집계에 걸쳐 있어야 합니다. 데이터는 비선형 회귀를 사용하여 표시되며 각 표본(표준 및 검정)의 EC₅₀ 값이 결정됩니다. 활성을 할당하려면 표준물질의 EC₅₀ 값을 테스트의 값으로 나누어 얼마나 더 강력하거나 덜 강력한지 결정하고 그에 따라 농도를 조정하십시오. 이 접근법은 동일한 생물학적 ‘활성’이 분석에 몇 번이고 추가되도록 합니다.

Introduction

우리 중 많은 사람들이 실험에서 생물학적 작용제와 길항제를 사용하며, 특정 조건에서 세포 기능에 미치는 영향을 정량화하는 생물학적 분석에서 가장 자주 사용합니다. 여기에 설명된 방법은 혈소판을 활성화하고 다양한 분석(광 투과 응집법, 현미경, 유세포 분석, Ca²⁺ 방출 등)에서 활성을 측정할 수 있는 당단백질 VI 작용제인 혈소판 작용제 콜라겐 관련 펩타이드(CRP-XL)에 대한 것이지만, 작용제 표준화 프로토콜은 모든 생물학적 작용제/길항제 및/또는 생물학적 검정에 적용할 수 있습니다. 물리학은 일상 업무 관행에서 표준물질의 사용에 정통하며, 상업 부문에서 바이오치료제를 개발하는 회사들은 참조 표준물질¹ 사용의 가치를 이해하고 있지만, 많은 생물학 과학자들, 특히 학술 연구 커뮤니티에서 표준물질의 활용도가 낮으며, 표준물질의 사용 부족은 과학적 결과물의 질에 부정적인 영향을 미친다.

CRP-XL은 1995년² 이후 혈소판 분야에서 수십 년 동안 사용되어 온 특정 GPVI 특이적 작용제로, ^3,4 이후 커뮤니티에서 GPVI의 역할을 다른 콜라겐 결합 혈소판 단백질의 역할과 구분하는 데 도움이 됩니다. 이 작용제는 다양한 상업적 출처에서 조달하거나 사내에서 생산할 수 있습니다. 펩타이드 단량체는 공급업체로부터 구매한 후 사내에서 가교하거나 공급업체가 추가 비용을 지불하고 가교할 수 있습니다. 배송 시 필요한 순도를 줄임으로써 비용을 추가로 절감할 수 있습니다(예: 70% 대 95%). 또한 CRP-XL을 보관하는 방법에 대한 합의가 이루어지지 않았으며, 일부는 냉동 보관을 선택하고 일부는 사용할 때까지 재료를 동결 건조하여 보관하고 다른 일부는 용액(선호도에 따라 물 또는 완충액)에 보관합니다. 따라서 실험실 스톡의 품질과 구성은 표준화되지 않았거나 조화를 이루지 못했습니다. 이 작용제는 활성 단위가 아닌 정의된 농도(질량/부피)로 사용되기 때문에 한 실험실에서 CRP-XL의 효능(예: 1μg/mL)은 다른 실험실과 동일하지 않습니다. 현장에서 사용되는 다른 혈소판 작용제는 이미 표준화되어 있으므로(예: 트롬빈은 질량/부피가 아닌 활동 단위로 공급 및 사용됨) 질량/부피에서 생물학적 단위로의 이동이 커뮤니티에 너무 어렵지 않아야 합니다. 또한 CRP-XL을 포함한 혈소판 작용제에 대한 환자의 반응은 작용제에 대한 민감도와 반응 능력(반응 정도) 측면에서 다양하므로⁵ 분석에서 일관된 양의 작용제 활성을 사용하는 것이 훨씬 더 중요합니다.

혈소판 작용제를 중량/부피가 아닌 정의된 활성으로 사용하여 조화시킬 수 있다면 한 실험실의 실험을 다른 실험실의 실험과 직접 비교할 수 있고 자신 있게 정확하게 재현할 수 있습니다. 현장에서 CRP-XL 활동을 저장하고 표준화하는 방법에 대한 합의에 도달할 때까지 재료가 사용되는 수개월/년 동안 일관성을 보장하기 위해 재료를 정기적으로 점검하는 것이 중요합니다.

생물학적 표준물질에 대한 활성값 할당은 협력적인 다기관 연구(예: ^6,7)를 통해 수행되어야 하며 전문 지식이 필요합니다. 혈소판 작용제에 대한 확립된 생물학적 표준의 필요성은 최근 국제 혈전증 및 지혈 학회(International Society for Thrombosis and Haemostasis, ISTH)가 지원하는 다기관 협력 연구⁸에 의해 강조되었다. 국제 CRP-XL 표준이 제공될 때까지 연구자들은 시간이 지남에 따라 일관성을 보장하기 위해 현지에서 자체 재료를 표준화할 수 있으며, 상업적 또는 사내에서 조달된 새로운 재료는 이전 준비 및 나머지 커뮤니티의 준비와 유사한 활동을 할 수 있습니다.

Protocol

혈액은 동의한 건강한 지원자로부터 채취하여 현지 규칙에 따라 처리해야 합니다. 이 프로토콜은 광 투과 응집법(LTA)에 의해 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 작용제 유도 혈소판 응집을 측정합니다. ISTH는 PRP 준비를 위한 2013년 방법 및 LTA9를 포함하여 표준화된 프로토콜을 제공합니다.  지역 윤리 위원회 규칙에 따라 ISTH 권장 사항에 따라 전혈을 4% 구연산나트륨으로 수집합니다. 지난 2주 이내에 비스테로이드성 항염증제(NSAID)를 복용한 기증자는 제외합니다. 1. 분석 절차 스톡 CRP-XL의 분취액을 분석(Tyrodes10) 완충액(표 1)에서 최대 응집을 유발하는 시작 농도로 희석합니다(1.3단계 아래 참고 참조).참고: 문헌에서 1μg/mL의 농도는 최대 응집을 유도하지만 일부 실험실에서는 동일한 효과에 도달하기 위해 더 높은 농도가 필요합니다 농도가 테스트 시약과 동일하도록 표준물질(1.3단계 및 그림 1 아래의 참고 참조)과 해당 희석 시리즈를 만듭니다. 분석 버퍼에서 테스트 및 표준물질에 대한 6-8점 희석 시리즈를 생성하여 응집 반응을 100%에서 0% 응집으로 가져옵니다. 8점 희석 계열 농도 곡선을 보여주는 예가 표 2에 나와 있습니다.참고: 일부 실험실은 총 10% 분석 부피(예: 50μL의 작용제와 450μL의 혈소판)로 작용제를 추가하여 분석에서 10배 농도를 최종 1배 농도로 희석하는 반면, 다른 실험실에서는 더 작은(더 농축된) 부피의 작용제(예: 5μL의 작용제와 495μL의 혈소판)를 추가합니다. 혈소판 농도에 영향을 미칩니다 – 다시 말하지만, 일관성을 유지하십시오. 이 예에서는 30μL의 10x 작용제를 270μL의 혈소판 풍부 혈장(PRP)에 첨가합니다. 혈소판이 휴식을 취하고 사용할 준비가 되면 LTA 큐벳에 분주하고 교반 막대를 추가한 다음 홀딩 웰에서 37°C에 도달하도록 합니다. 온도에 도달하면 큐벳을 응집계에 놓고 트레이스 기록을 시작합니다. 작용제(교반 포함)를 추가하고 데이터를 기록합니다. 곡선을 그리는 데 필요한 데이터가 수집될 때까지 테스트 및 표준물질의 각 농도에 대해 1.4단계를 반복합니다(예: 그림 2에 표시된 곡선). 표준물질과 비교하여 테스트 시약의 효능을 계산합니다. 다시 말하지만, 일관성이 있고 분석 모델이 데이터에 적절하게 맞는 한 메트릭(최대 집계 또는 곡선 아래 영역)을 사용합니다. 2. 농도 곡선 확인 먼저 농도 반응 곡선이 평행한지 확인합니다. 이 작업을 수행하는 많은 소프트웨어 패키지가 있지만 여기서는 Graphpad Prism에 대한 프로세스를 설명합니다( 그림 3 참조).log(concentration)가 X축에 있고 반응(% maximum aggregation/AUC)이 Y축에 오도록 데이터를 입력합니다(그림 3A). CRP-XL 농도 변환(그림 3B) 분석 함수에서 비선형 회귀 분석을 선택하고 용량-반응 자극/억제에 대한 방정식을 사용합니다. 로그(작용제) 대 반응(가변 기울기) 선택 – 데이터에 가장 적합한 것에 따라 3-차 또는 4-차 적합치를 사용합니다. 비교 탭(그림 3C 참조)을 사용하여 곡선이 평행한지 여부를 확인하고 버튼을 클릭하여 데이터 세트를 비교하여 경사(언덕 경사)와 점근선(곡선의 위쪽 및 아래쪽)이 동일한지 확인합니다. 이 예에서 검정의 언덕 기울기는 2.279이고 표준의 언덕 기울기는 2.025로 비율은 1.125입니다. 기울기가 평행하고(예: 경사 비율의 허용 기준이 0.8-1.25 사이) 점근선이 동일한 경우 2.1.3 및 2.1.4단계를 사용하여 잠재력(EC50) 계산을 진행합니다. 여기에 표시된 예에서는 2.1.5단계의 평가에서 점근선이 동일하다는 것이 확인됨에 따라 점근선이 제한되었습니다. 표준물질의 EC50 값을 테스트의 값으로 나누어 상대적 효능을 결정합니다. 여기에 표시된 예에서 test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, 즉 ‘test’는 표준의 절반만큼 강력합니다. 효능의 차이를 설명하기 위해 질량/부피 농도를 조정합니다(예: 표준물질이 이전에 1μg/mL에서 사용된 경우 새로운 물질은 1/0.4846 = 2.063μg/mL)에서 사용되어 비슷한 양의 활성 물질이 실험에 사용되도록 합니다.

Representative Results

그림 1은 희석 시리즈를 도식적으로 표현한 것으로, 표준물질과 테스트 모두에 희석 시리즈가 필요하다는 것을 강조하기 위한 것입니다. 그림 2A는 표준물질에 대한 집계 트레이스를 보여주며, 테스트 데이터는 그림 2B에 나와 있습니다. 0.075μg/mL에서는 표준물질에 대한 명확한 반응이 있는 반면, 테스트의 경우 해당 농도(0.075μg/mL)는 평평합니다. 이 데이터는 EC50을 제공하기 위해 후속 그래프를 그리는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 예에서는 그림 3과 같이 100% 최대 응집을 사용하여 농도-반응 곡선을 표시하고 EC50을 결정했습니다. 그림 1: 테스트의 두 희석 시리즈(왼쪽)와 표준물질(오른쪽)에 대한 그래픽 설명. 최고 농도(권장 농도: 10μg/mL CRP-XL)부터 시작하여 순차적 1/2 희석이 8개 지점(>3 log 단위)에 걸쳐 병렬로 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 표준물질(왼쪽) 및 테스트 희석 시리즈(오른쪽)에 대한 응집 트레이스. 혈소판 응집이 진행되면(x축) 샘플을 통과하여 센서에 도달하는 빛의 양이 증가합니다(y축). (A) 표준. (B) 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 데이터 입력 및 분석. (A) 데이터를 입력하고, (B) 변환하고, (C,D) 평행도를 분석합니다(언덕 경사와 점근선이 비교 가능한지 알려달라고 소프트웨어에 요청). (E) 곡선이 평행한 경우 비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 효능(EC50)을 결정합니다. (F) 표시된 변환 데이터. 자세한 내용은 방법을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 티로드 버퍼9 성분 농도 코멘트 염화나트륨 134 밀리미터 Na2HPO4 개 0.34 밀리미터 케이클 2.9 밀리미터 NaHCO3 재질 보기 12 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 20 밀리미터 포도당 5 mM 마그네슘화합물 2 1 mM 산도 7.3 표 1: Tyrodes 완충액의 구성. 8 포인트 희석 시리즈 희석 1 10μg/mL 희석 2 5μg/mL 희석 3 2.5μg/mL 희석 4 1.25μg/mL 희석 5 0.625μg/mL 희석 6 0.3125μg/mL 희석 7 0.15625 μg/mL 희석 8 0.073125 μg/mL 표 2: 8점 희석 시리즈를 보여주는 예.

Discussion

여기에서 볼 수 있듯이 재료를 표준화하는 과정은 매우 간단합니다. 새로운 재료 배치를 평가하거나 현재 배치가 안정적이고 시간이 지남에 따라 활성을 잃지 않는지 확인하는 데 약간의 시간이 필요하지만, 시약 배치의 수명뿐만 아니라 실험을 몇 번이고 재현할 수 있고 수년에 걸쳐 비교할 수 있다는 보상이 있습니다. 이는 또한 다른 연구자들이 분석 조건을 정확하게 재현할 수 있고 커뮤니티가 글로벌 수준에서 조화를 이룰 수 있음을 의미합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 전혈 수집 및 PRP 준비⁹와 희석 시리즈를 만들 때의 정밀도가 포함됩니다. EC₅₀ 비교를 진행하기 전에 테스트 곡선과 표준 곡선이 평행한지 확인하는 것도 중요합니다. 선이 평행하지 않거나 점근선이 동일하지 않으면 테스트 및 표준 재료가 어느 정도 다르다는 것을 나타낼 수 있습니다.

생물학 분야에서 일하는 모든 사람은 생물학적 분석이 항상 일관되게 수행되는 것은 아니라는 것을 알고 있으므로 데이터를 평가할 때 이를 염두에 두어야 합니다. 여기에 표시된 예에서 동일한 공여체를 사용하여 동일하지는 않더라도 매우 유사한 두 물질의 효능을 측정하더라도 언덕 경사면과 점근선은 동일하지 않습니다. 그러나 우리는 어느 정도의 변동성을 인정하고 이 경우 곡선이 평행하므로 효능을 비교하고 조정하는 데 적합하다는 결론을 내립니다. 생물학적 분자는 크고 복잡하며, 제조 중 번역 후 변형은 생물학적 분석에서 분자의 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체 분자 및 생물 분석의 표준화는 질량 또는 부피만으로는 수행할 수 없으며 생물 검정¹¹에서 생물학적 활성을 정량화하고 비교하여 수행해야 합니다. 자신의 교육과 경험을 사용하여 분석의 맥락에서 데이터를 평가해야 합니다.

이 기술의 한계는 데이터가 시약에 문제가 있음을 나타낼 수 있지만 문제가 무엇인지 알려줄 수 없다는 것입니다. 재료가 비교할 수 없는 이유를 결정하기 위해 추가 작업이 필요합니다. 이상적인 세계에서는 실험 및 후속 과학적 결론에 중요한 모든 물질이 질량 분광법으로 검증되지만 이것이 항상 선택 사항은 아닙니다. 그러나 데이터를 비교할 수 없는 경우 추가 조사가 어느 정도 필요합니다. 이 접근 방식의 또 다른 한계는 이를 수행하는 데 필요한 시간과 리소스입니다. 이상적으로는 3-6명의 기증자를 대상으로 테스트와 표준물질을 비교하여 물질에 생물학적 활성을 부여하는 데 어느 정도 확신을 주어야 하지만, 재현성과 신뢰성을 뒷받침함으로써 이것이 정당화될 수 있다고 생각합니다. 실험을 실행할 때마다 생물학적 물질의 표준화가 필요한 것은 아니지만, 최소한 안정성과 용도에 따라 새로운 작용제 배치마다 더 자주 표준화해야 합니다. 실제로, 표준이 제공된다면, 이는 국제 표준화 기구가 명확하게 제공할 수 있는 것입니다.

여기에 표시된 예는 혈소판 응집 측정의 맥락에서 CRP-XL에 대한 것이지만, 생물학적 분석에서 생체 분자의 생물학적 활성을 비교하는 프로토콜은 해당 분야 전반에 걸쳐 널리 적용됩니다.

Materials

4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.