Biyolojik Standartlar Kullanılarak Yapılan Araştırmalarda Tekrarlanabilirlik ve Uyum: Trombosit Agonisti Kollajen İlişkili Peptit Örneği

Summary

Burada, ışık geçirgenlik agregometrisi kullanarak trombosit agonisti kollajen ile ilişkili peptit çapraz bağlı (CRP-XL) standardize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Protokol trombosit fonksiyonunu hedeflerken, deneysel süreç, bilimsel titizlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için çoğu biyolojik moleküle ve biyo-tahlillere uygulanabilir.

Abstract

Metroloji – ölçü bilimi – çok az biyolojik bilim insanının eğitimlerinde kendi zararlarına öğretildiği bir konudur; Basit standardizasyon süreçlerinin günlük çalışma uygulamalarına uygulanması, verilere güven ve mesafe ve zaman içinde tekrarlanabilirlik sağlar.

Bu yöntem, hemostaz araştırmalarında ve klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan bir çekirdek laboratuvar deneyinin nasıl standartlaştırılacağını, özellikle trombosit kollajen reseptörüne (glikoprotein [GP]VI) agonist kollajenle ilişkili peptit, çapraz bağlı (CRP-XL) ışık geçirgenlik agregometrisi (LTA) ile yanıtların nasıl standartlaştırılacağını gösterir. Bu yaklaşımın kullanılması, agonist stoğu veya tedarikçisinden bağımsız olarak laboratuvar içi tekrarlanabilirliği ve laboratuvarlar arası uyumu sağlayacaktır. Daha da önemlisi, bu yöntem diğer trombosit agonistlerine ve aslında diğer birçok biyolojik moleküle ve biyo-tahlillere uygulanabilir.

Aşağıda özetlenen işlem, ‘standart’ ve ‘test’in (kontrol ettiğiniz malzeme) 6-8 noktalı bir seyreltme serisinin yapılmasını ve bunların seçilen bir tahlilde (bu durumda LTA) yan yana çalıştırılmasını içerir. CRP-XL, kütle/hacim konsantrasyonlarında kullanılır, ancak her malzeme belirli bir konsantrasyonda aynı biyolojik aktiviteyi vermez, bu nedenle standart ve test malzemesini karşılaştırmak ve eşdeğer aktivite vermek için hangi konsantrasyonun gerekli olduğunu belirlemek için bir seyreltme serisi yapılır. Seyreltme serisi %0-100 agregasyonu kapsamalıdır. Veriler doğrusal olmayan regresyon kullanılarak çizilir ve her numunenin (standart ve test) EC₅₀ değeri belirlenir. Aktivite atamak için, standardın EC₅₀ değerini, ne kadar az ya da çok etkili olduğunu belirlemek için testin değerine bölün ve konsantrasyonu buna göre ayarlayın. Bu yaklaşım, aynı biyolojik ‘aktivitenin’ teste tekrar tekrar eklenmesini sağlayacaktır.

Introduction

Birçoğumuz deneylerimizde, çoğunlukla belirli koşullar altında hücre fonksiyonu üzerindeki etkilerini ölçen biyolojik bir tahlilde biyolojik agonistler ve antagonistler kullanırız. Burada tarif edilen yöntem, trombositleri aktive eden ve aktivitesi çeşitli tahlillerde (ışık geçirgenliği agregometrisi, mikroskopi, akış sitometrisi, Ca²⁺ salımı, vb.) ölçülebilen bir glikoprotein VI agonisti olan trombosit agonisti kollajen ile ilişkili peptit, çapraz bağlı (CRP-XL) içindir, ancak agonist standardizasyon protokolü herhangi bir biyolojik agonist/antagonist ve/veya biyoassay için geçerlidir. Fiziksel bilimler, günlük çalışma uygulamalarında standartların kullanımı konusunda çok bilgilidir ve ticari sektörde biyoterapötik ilaçlar geliştiren şirketler, referans standartları¹ kullanmanın değerini anlamaktadır, ancak birçok biyolojik bilim adamı tarafından yeterince kullanılmamaktadır, özellikle akademik araştırma topluluğunda ve kullanım eksiklikleri bilimsel çıktının kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir.

CRP-XL, trombosit alanının 1995’teki tanımından bu yana onlarca yıldır kullandığı spesifik bir GPVI’ya özgü agonisttir² ve topluluğun GPVI’nın rolünü ^3,4’ten beri diğer kollajen bağlayıcı trombosit proteinlerinden ayırmasına yardımcı olur. Bu agonist, çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir veya şirket içinde üretilebilir. Peptit monomeri bir tedarikçiden satın alınabilir ve daha sonra şirket içinde çapraz bağlanabilir veya bu, tedarikçi tarafından ekstra bir ücret karşılığında yapılabilir. Teslimat sırasında gerekli saflığın azaltılmasıyla daha fazla maliyet tasarrufu sağlanabilir (örneğin, %70’e karşı %95). CRP-XL’in nasıl saklanması gerektiği konusunda da bir fikir birliği yoktur, bazıları kriyodepolamayı ve diğerleri soğutmayı tercih eder, bazıları malzemeyi kullanıma kadar liyofilize tutar ve diğerleri onu çözelti içinde saklar (tercihe bağlı olarak su veya tampon). Bu nedenle, laboratuvar stoklarının kalitesi ve bileşimi standartlaştırılmamış veya uyumlaştırılmamıştır. Bu agonist, aktivite birimlerinden ziyade tanımlanmış bir konsantrasyonda (kütle / hacim) kullanıldığından, CRP-XL’nin bir laboratuvarda, örneğin 1 μg / mL’de gücü diğeriyle aynı olmayacaktır. Sahada kullanılan diğer trombosit agonistlerinin zaten standardize edildiğini belirtmekte fayda var (örneğin, kütle / hacimden ziyade aktivite birimlerinde sağlanan ve kullanılan trombin), bu nedenle kütle / hacimden biyolojik birimlere doğru hareket toplum için çok zor olmamalıdır. Ayrıca, CRP-XL de dahil olmak üzere trombosit agonistlerine hasta yanıtlarının, agonistlere duyarlılıkları ve yanıt verme kapasiteleri (yanıt derecesi) açısından değişken olduğu ^{belirtilmelidir5}, bu nedenle testlerde tutarlı miktarlarda agonist aktivitesi kullanmak daha da önemlidir.

Trombosit agonistleri, ağırlık/hacim yerine tanımlanmış bir aktivitede kullanılarak uyumlu hale getirilebilirse, bir laboratuvardaki bir deneyin diğer laboratuvarlardakiyle doğrudan karşılaştırılabilir olması ve güvenle doğru bir şekilde çoğaltılabilmesi sağlanabilir. Saha, CRP-XL aktivitesinin nasıl depolanacağı ve standartlaştırılacağı konusunda bir anlaşmaya varana kadar, kullanıldığı aylar/yıllar boyunca tutarlılığını sağlamak için malzeme üzerinde düzenli kontroller yapmak esastır.

Biyolojik standartlar için aktivite değeri ataması, işbirliğine dayalı, çok merkezli çalışmalar yoluyla yapılmalıdır (örneğin ^6,7) ve uzmanlık gerektirir. Trombosit agonistleri için yerleşik biyolojik standartlara duyulan ihtiyaç, yakın zamanda Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği (ISTH) tarafından desteklenen ortak bir çok merkezli çalışma⁸ ile vurgulanmıştır; Uluslararası bir CRP-XL standardı mevcut olana kadar, araştırmacılar zaman içinde tutarlılığı sağlamak için kendi materyallerini yerel olarak standartlaştırabilirler ve ticari olarak veya kurum içinde tedarik edilen yeni materyal, önceki hazırlıklarla ve topluluğun geri kalanıyla karşılaştırılabilir bir aktiviteye sahiptir.

Protocol

Kan, rıza gösteren sağlıklı gönüllülerden alınmalı ve yerel kurallara uygun olarak işlenmelidir. Bu protokol, ışık geçirgenlik agregometrisi (LTA) ile trombositten zengin plazmada (PRP) agonist kaynaklı trombosit agregasyonunu ölçer. ISTH, PRP hazırlama ve LTA9 için 2013 yöntemi de dahil olmak üzere standartlaştırılmış protokoller sağlar.  Tam kanı, yerel etik kurul kurallarına uygun olarak ISTH tavsiyelerine göre% 4 sodyum sitrat halinde toplayın. Son 2 hafta içinde herhangi bir NSAID almış olan bağışçıları hariç tutun. 1. Tahlil prosedürü Stok CRP-XL’den bir alikot alın ve tahlil (Tyrodes10) tamponunda (Tablo 1) maksimum agregasyona neden olacak bir başlangıç konsantrasyonuna seyreltin (aşağıdaki NOT’a bakın, adım 1.3).NOT: Literatürde, 1 μg/mL’lik bir konsantrasyon maksimum agregasyonu indükleyecektir, ancak bazı laboratuvarlar aynı etkiye ulaşmak için daha yüksek konsantrasyonlara ihtiyaç duyar – seyreltme serisini buna göre ayarlayın Konsantrasyonlar test reaktifi ile aynı olacak şekilde standartla karşılık gelen bir seyreltme serisi yapın (aşağıdaki NOTA bakın adım 1.3 ve Şekil 1). Test ve standart için 6 ila 8 noktalı bir seyreltme serisi üretin, yine tahlil tamponunda, agregasyon yanıtını 0’den %0 agregasyona alır. 8 noktalı seyreltme serisi konsantrasyon eğrisini gösteren bir örnek Tablo 2’de gösterilmektedir.NOT: Bazı laboratuvarlar toplam tahlil hacminde agonist ekler, ör., 50 μL agonist ila 450 μL trombosit, böylece 10x konsantrasyonu tahlilde son 1x konsantrasyona seyreltirler, diğerleri ise daha küçük (daha konsantre) hacimlerde agonist ekler, ör., 5 μL agonist ila 495 μL trombosit – sadece seyreltme serisinin hacim yer değiştirmesinin nasıl olduğunu göz önünde bulundurarak test için uygun olduğundan emin olun. trombosit konsantrasyonunu etkiler – yine tutarlı olun. Örnekte, 270 μL trombositten zengin plazmaya (PRP) 30 μL 10x agonist eklenir. Trombositler dinlendirilip kullanıma hazır hale geldikten sonra, bunları LTA küvetlerine ayırın, bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bekletme kuyucuklarında 37 °C’ye ulaşmalarını sağlayın. Sıcaklığa geldikten sonra, küvet(ler)i toplayıcıya yerleştirin ve iz(ler)i kaydetmeye başlayın. Agonisti ekleyin (karıştırarak) ve verileri kaydedin. Eğrileri çizmek için gereken veriler toplanana kadar testin ve standardın her konsantrasyonu için adım 1.4’ü tekrarlayın ( Şekil 2’de gösterilen örnek eğriler). Test reaktifinin standarda göre gücünü hesaplayın; Yine, tutarlılık olduğu ve analiz modeli verilere uygun şekilde uyduğu sürece herhangi bir metriği (maksimum toplama veya eğrinin altındaki alan) kullanın. 2. Konsantrasyon eğrilerinin kontrol edilmesi İlk olarak, konsantrasyon tepki eğrilerinin paralel olup olmadığını kontrol edin. Bunu yapan birçok yazılım paketi vardır, ancak burada işlem Graphpad Prism için açıklanmıştır (bkz. Şekil 3).Verileri, log(konsantrasyon) X ekseninde ve yanıt (% maksimum toplama/AUC) Y ekseninde olacak şekilde girin (Şekil 3A) CRP-XL konsantrasyonlarını dönüştürün (Şekil 3B) Analiz işlevlerinden Doğrusal Olmayan Regresyon’u seçin ve doz-yanıt stimülasyonu/inhibisyonu denklemini kullanın. Günlük (agonist) ve yanıt (değişken eğim) seçeneklerini belirleyin – veriler için hangisinin en iyi olduğuna bağlı olarak 3 veya 4 yönlü uyum kullanın. Karşılaştır sekmesini kullanarak eğrilerin paralel olup olmadığını belirleyin (Şekil 3C’de gösterildiği gibi) ve eğimin (Tepe eğimi) ve asimptotların (eğrilerin Üst ve Alt) eşdeğer olduğundan emin olmak için veri kümelerini karşılaştırmak için düğmeye tıklayın. Bu örnekte, test için Yokuş eğimi 2.279’dur ve standardın eğimi 2.025’tir ve 1.125’lik bir oran verir. Eğimler paralelse (örneğin, 0,8-1,25 arasında bir eğim oranı kabul kriteri) ve asimptotlar eşdeğerse, 2.1.3 ve 2.1.4 adımlarını kullanarak potens (EC50) hesaplamasına devam edin. Burada gösterilen örnekte, adım 2.1.5’teki değerlendirme asimptotların eşdeğer olduğunu doğruladığı için asimptotlar kısıtlanmıştır. Bağıl gücü belirlemek için standardın EC50 değerini testin değerine bölün. Burada gösterilen örnekte, test/standart (0.07259/0.1498) = 0.4846, yani ‘test’ standardın yarısı kadar güçlüdür. Kütle/hacim konsantrasyonlarını potens farkını hesaba katacak şekilde ayarlayın, yani standart daha önce 1 μg/mL’de kullanılmışsa, yeni malzeme 1/0.4846 = 2.063 μg/mL’de kullanılacaktır) deneylerde karşılaştırılabilir miktarlarda aktif malzeme kullanıldığından emin olmak için

Representative Results

Şekil 1, bir seyreltme serisinin şematik bir temsilidir ve hem standart hem de test için bir seyreltme serisinin gerekli olduğunu vurgulamak içindir. Şekil 2A, standart için toplama izlerini gösterirken, test verileri Şekil 2B’de gösterilmektedir. 0.075 μg/mL’de standarda net bir yanıt varken, test için karşılık gelen konsantrasyon (0.075 μg/mL) düzdür, yani yanıt yoktur. Bu veriler, EC50’yi vermek için sonraki grafikleri çizmek için kullanılır. Burada gösterilen örnekte, Şekil 3’te gösterildiği gibi, konsantrasyon-tepki eğrisini çizmek ve EC 50’yi belirlemek için 0 maksimum agregasyon kullanılmıştır. Şekil 1: Testin (solda) ve standardın (sağda) iki seyreltme serisinin grafiksel açıklaması. En yüksek konsantrasyondan başlayarak (önerilen konsantrasyon: 10 μg/mL CRP-XL), sıralı 2’de 1 seyreltme, 8 nokta (>3 log birimi) üzerinde paralel olarak yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Standart (solda) ve test seyreltme serileri (sağda) için toplama izleri. Trombosit agregasyonu ilerledikçe (x ekseni), numuneden geçen ve sensöre ulaşan ışık miktarı artar (y ekseni). (A) Standart. (B) Test. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Veri girişi ve analizi. (A) Veriler girilir, (B) dönüştürülür ve (C,D) paralellik açısından analiz edilir (yazılımdan Hill eğimlerinin ve asimptotların karşılaştırılabilir olup olmadığını söylemesini isteyin [C]). (E) Eğriler paralelse, doğrusal olmayan regresyon eğrisi uydurma kullanarak potensi (EC50) belirleyin. (F) Çizilen dönüştürülmüş veriler. Daha fazla ayrıntı için lütfen yönteme bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tyrodes tamponu9 Bileşen Konsantrasyon Yorum NaCl (Sıvı Değeri) 134 milyon Na2HPO4 0,34 milyon Kartal 2,9 milyon NaHCO3 12 milyon 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) 20 milyon Glikoz 5 milyon MgCl2 1 milyon pH 7.3 Tablo 1: Tyrodes tamponunun bileşimi. 8 noktalı seyreltme serisi Seyreltme 1 10 μg/mL Seyreltme 2 5 μg/mL Seyreltme 3 2,5 μg/mL Seyreltme 4 1,25 μg/mL Seyreltme 5 0,625 μg/mL Seyreltme 6 0.3125 μg/mL Seyreltme 7 0.15625 μg/mL Seyreltme 8 0.073125 μg/mL Tablo 2: 8 noktalı seyreltme serisini gösteren bir örnek.

Discussion

Burada gösterildiği gibi, malzemeleri standartlaştırma süreci çok basittir. Yeni malzeme partilerini değerlendirmek ve/veya mevcut partinin stabil olup olmadığını ve zaman içinde aktivite kaybetmediğini kontrol etmek biraz zaman gerektirse de, ödül, deneylerin tekrar tekrar tekrarlanabilir olması ve sadece bir reaktif partisinin ömründen ziyade yıllar içinde karşılaştırılabilir olmasıdır. Aynı zamanda, diğer araştırmacıların tahlil koşullarını doğru bir şekilde yeniden oluşturabileceği ve topluluğun küresel düzeyde uyumlu hale getirildiği anlamına gelir. Protokoldeki kritik adımlar, tam kan alma ve PRP preparatı^9’un yanı sıra seyreltme serisini yaparken hassasiyeti içerir. EC₅₀ karşılaştırmasına geçmeden önce test ve standart eğrilerin paralel olduğundan emin olmak da önemlidir. Çizgiler paralel değilse veya asimptotlar eşdeğer değilse, test ve standart malzemenin bir dereceye kadar farklı olduğunu gösterebilir.

Biyolojik bilimlerde çalışan herkes, biyolojik tahlillerin her zaman tutarlı bir şekilde çalışmadığını bilir, bu nedenle verileri değerlendirirken buna dikkat etmek gerekir. Burada gösterilen örnekte, aynı olmasa da çok benzer iki malzemenin gücünü ölçmek için aynı donörleri kullanıyor olsak da, tepe yamaçları ve asimptotlar aynı değildir. Yine de bir dereceye kadar değişkenliği kabul ediyoruz ve eğrilerin bu durumda paralel olduğu ve bu nedenle potansiyeli karşılaştırmak ve ayarlamak için uygun olduğu sonucuna varıyoruz. Biyolojik moleküller büyük ve karmaşıktır ve üretim sırasındaki translasyon sonrası modifikasyonlar, biyo-tahlillerdeki güçlerini etkileyebilir. Biyomoleküllerin ve biyoanalizlerin standartlaştırılması sadece kütle veya hacim kullanılarak yapılamaz ve bir biyo-tahlildeki biyolojik aktivitenin ölçülmesi ve karşılaştırılması ile yapılmalıdır¹¹. Kişi, verileri tahlil bağlamında değerlendirmek için eğitimini ve deneyimini kullanmalıdır.

Tekniğin sınırlamaları, veriler reaktif(ler)le ilgili bir soruna işaret etse de, sorunun ne olduğunu size söyleyememesidir. Malzemelerin neden karşılaştırılabilir olmadığını belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır. İdeal bir dünyada, deney(ler) ve müteakip bilimsel sonuçlar için kritik olan herhangi bir materyal kütle spektroskopisi ile doğrulanacaktır, ancak bu her zaman bir seçenek değildir. Bununla birlikte, veriler karşılaştırılabilir değilse, yine de bir miktar kapasitede daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Bu yaklaşımın bir diğer sınırlaması, bunu yapmak için gereken zaman ve kaynaklardır. İdeal olarak, materyale biyolojik aktivite atama konusunda bir miktar güven sağlamak için test ve standart 3-6 donörde karşılaştırılmalıdır, ancak bunun tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği destekleyerek haklı olduğunu düşünüyoruz. Deneyler her yapıldığında biyolojik materyalin standartlaştırılmasına gerek yoktur, ancak en azından, stabilite ve kullanıma bağlı olarak her yeni agonist grubu için, tercihen daha sık yapılmalıdır. Gerçekten de, bir standart kullanıma sunulursa, bu, uluslararası standardizasyon kuruluşlarının netlik sağlayabileceği bir şeydir.

Burada gösterilen örnek, trombosit agregasyonunun ölçülmesi bağlamında CRP-XL için olsa da, biyo-tahlillerde biyomoleküllerin biyolojik aktivitesini karşılaştırma protokolü sektör genelinde yaygın olarak uygulanabilir.

Materials

4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.