Her presenterer vi en rask og kostnadseffektiv arbeidsflyt for karakterisering av rabiesvirus (RABV) genomer ved hjelp av nanopore-teknologi. Arbeidsflyten er ment å støtte genomikkinformert overvåking på lokalt nivå, og gi informasjon om sirkulerende RABV-linjer og deres plassering i regionale fylogenier for å veilede rabieskontrolltiltak.
Genomiske data kan brukes til å spore overføring og geografisk spredning av smittsomme sykdommer. Imidlertid er sekvenseringskapasiteten som kreves for genomisk overvåking fortsatt begrenset i mange lav- og mellominntektsland (LMICs), hvor hundmediert rabies og / eller rabies overført av dyreliv som vampyrflaggermus utgjør store folkehelse og økonomiske bekymringer. Vi presenterer her en rask og rimelig arbeidsflyt fra prøve til sekvens til tolkning ved hjelp av nanopore-teknologi. Protokoller for prøveinnsamling og diagnostisering av rabies er kort beskrevet, etterfulgt av detaljer om den optimaliserte arbeidsflyten for helgenomsekvensering, inkludert primerdesign og optimalisering for multiplex polymerasekjedereaksjon (PCR), en modifisert, billig sekvenseringsbibliotekforberedelse, sekvensering med live og offline baseanrop, genetisk avstamningsbetegnelse og fylogenetisk analyse. Implementering av arbeidsflyten demonstreres, og kritiske trinn fremheves for lokal distribusjon, for eksempel pipelinevalidering, primeroptimalisering, inkludering av negative kontroller og bruk av offentlig tilgjengelige data og genomiske verktøy (GLUE, MADDOG) for klassifisering og plassering innen regionale og globale fylogenier. Behandlingstiden for arbeidsflyten er 2-3 dager, og kostnadene varierer fra $ 25 per prøve for en 96-prøvekjøring til $ 80 per prøve for en 12-prøvekjøring. Vi konkluderer med at det er mulig å sette opp genomisk overvåking av rabiesvirus i LMICs og kan støtte fremgang mot det globale målet om null hundemedierte menneskelige rabiesdødsfall innen 2030, samt forbedret overvåking av rabiesspredning av dyreliv. Videre kan plattformen tilpasses andre patogener, og bidra til å bygge en allsidig genomisk kapasitet som bidrar til epidemi- og pandemiberedskap.
Rabiesviruset (RABV) er et lyssavirus i familien Rhabdoviridae som forårsaker en dødelig nevrologisk sykdom hos pattedyr1. Selv om rabies er 100% forebygges ved vaksinasjon, er det fortsatt en stor folkehelse og økonomisk bekymring i endemiske land. Av de 60.000 menneskelige rabiesdødsfallene som anslås å forekomme hvert år, er over 95% i Afrika og Asia hvor hunder er det primære reservoaret2. I motsetning til dette har hundevaksinasjon ført til eliminering av hundemediert rabies over hele Vest-Europa, Nord-Amerika og mye av Latin-Amerika. I disse regionene er reservoarer av rabies nå begrenset til dyreliv, som, vaskebjørn, stinkdyr og ville canids3. Over hele Latin-Amerika er den vanlige vampyrflaggermusen en problematisk kilde til rabies på grunn av regelmessig overføring fra til både mennesker og husdyr under nattlig blodfôring4. Den årlige globale økonomiske effekten av rabies anslås å være 8, 6 milliarder dollar, med husdyrtap som står for 6% 5.
Sekvensdata fra virale patogener kombinert med metadata om tidspunkt og smittekilde kan gi robust epidemiologisk innsikt6. For RABV har sekvensering blitt brukt til å undersøke opprinnelsen til utbrudd7,8, identifisere vertsforeninger med dyreliv eller husdyr 8,9,10,11,12 og spore kilder til menneskelige tilfeller 13,14. Utbruddsundersøkelser ved hjelp av fylogenetiske analyser har indikert at rabies dukket opp i den tidligere rabiesfrie provinsen Bali, Indonesia, gjennom en enkelt introduksjon fra de nærliggende endemiske områdene Kalimantan eller Sulawesi15. I mellomtiden, på Filippinene, ble et utbrudd på Tablas Island, Romblon-provinsen vist seg å være introdusert fra hovedøya Luzon16. Virale genomiske data har også blitt brukt til å bedre forstå patogenoverføringsdynamikken som kreves for å målrette kontrolltiltak geografisk. For eksempel illustrerer genomisk karakterisering av RABV den geografiske grupperingen av klader 17,18,19, samsirkulasjon av linjer 20,21,22, menneskemediert virusbevegelse 17,23,24 og metapopulasjonsdynamikk 25,26.
Sykdomsovervåking er en viktig funksjon av genomisk overvåking som har blitt forbedret med den globale økningen i sekvenseringskapasitet som svar på SARS-CoV-2-pandemien. Genomisk overvåking har støttet sanntidssporing av SARS-COV-2-varianter av bekymring27,28 og tilhørende mottiltak6. Fremskritt innen tilgjengelig sekvenseringsteknologi, som nanoporeteknologi, har ført til forbedrede og rimeligere protokoller for rask sekvensering av både humane 29,30,31,32 og dyr33,34,35 patogener. I mange rabiesendemiske land er det imidlertid fortsatt barrierer for operasjonalisering av patogengenomisk overvåking, som vist ved globale forskjeller i SARS-CoV-2-sekvenseringskapasitet36. Begrensninger i laboratorieinfrastruktur, forsyningskjeder og teknisk kunnskap gjør etablering og rutinisering av genomisk overvåking utfordrende. I denne artikkelen demonstrerer vi hvordan en optimalisert, rask og rimelig arbeidsflyt for helgenomsekvensering kan distribueres for RABV-overvåking i ressursbegrensede innstillinger.
En tilgjengelig RABV, nanopore-basert, helgenomsekvenseringsarbeidsflyt ble utviklet av Brunker et al.61, ved hjelp av ressurser fra ARTIC-nettverket46. Her presenterer vi en oppdatert arbeidsflyt, med komplette trinn fra prøve til sekvens til tolkning. Arbeidsflyten beskriver utarbeidelsen av hjernevevsprøver for helgenomsekvensering, presenterer en bioinformatikkrørledning for å behandle avlesninger og generere konsensussekvenser, og fremhever to rabiesspesifikke verktøy for å automatisere avstamningstildeling og bestemme fylogenetisk kontekst. Den oppdaterte arbeidsflyten inneholder også omfattende instruksjoner for oppsett av passende beregnings- og laboratoriearbeidsområder, med hensyn til implementering i forskjellige sammenhenger (inkludert innstillinger med lave ressurser). Vi har demonstrert vellykket implementering av arbeidsflyten i både akademiske og forskningsinstituttinnstillinger i fire RABV endemiske LMICs med ingen eller begrenset genomisk overvåkingskapasitet. Arbeidsflyten har vist seg å være motstandsdyktig mot bruk på tvers av ulike innstillinger, og forståelig for brukere med varierende ekspertise.
Denne arbeidsflyten for RABV-sekvensering er den mest omfattende offentlig tilgjengelige protokollen (som dekker trinn fra prøve til sekvens til tolkning) og er spesielt tilpasset for å redusere både oppstarts- og driftskostnader. Tiden og kostnadene som kreves for bibliotekforberedelse og sekvensering med nanopore-teknologi er sterkt redusert i forhold til andre plattformer, for eksempel Illumina61, og kontinuerlig teknologiutvikling forbedrer sekvenskvalitet og nøyaktighet for å være sammenlignbar med Illumina62.
Denne protokollen er designet for å være motstandsdyktig i ulike lavressurskontekster. Ved å referere til feilsøkings- og endringsveiledningen som gis sammen med kjerneprotokollen, støttes brukerne for å tilpasse arbeidsflyten til deres behov. Tilføyelsen av brukervennlige bioinformatiske verktøy til arbeidsflyten utgjør en stor utvikling av den opprinnelige protokollen, og gir raske og standardiserte metoder som kan brukes av brukere med minimal tidligere bioinformatikkerfaring for å tolke sekvensdata i lokale sammenhenger. Kapasiteten til å gjøre dette in situ er ofte begrenset av behovet for å ha spesifikke programmerings- og fylogenetiske ferdigheter, noe som krever en intensiv og langsiktig ferdighetstreningsinvestering. Selv om dette ferdighetssettet er viktig for å tolke sekvensdata grundig, er grunnleggende og tilgjengelige tolkningsverktøy like ønskelige for å kapasitere lokale “sekvenseringsmestere”, hvis kjernekompetanse kan være våtlaboratoriebasert, slik at de kan tolke og ta eierskap over dataene sine.
Siden protokollen har blitt gjennomført i flere år i flere land, kan vi nå gi veiledning om hvordan man optimaliserer multipleksprimerordninger for å forbedre dekningen og håndtere akkumulert mangfold. Det er også gjort en innsats for å hjelpe brukerne med å forbedre kostnadseffektiviteten eller for å gjøre det enkelt å anskaffe i en gitt region, noe som vanligvis er en utfordring for bærekraften til molekylæretilnærminger63. For eksempel, i Afrika (Tanzania, Kenya og Nigeria), valgte vi stump / TA ligase master mix på adapterligeringstrinnet, som var lettere tilgjengelig fra lokale leverandører og et billigere alternativ til andre ligeringsreagenser.
Av erfaring er det flere måter å redusere kostnaden per prøve og per kjøring. Å redusere antall prøver per kjøring (f.eks. fra 24 ned til 12 prøver) kan forlenge levetiden til flytceller over flere kjøringer, mens å øke antall prøver per kjøring maksimerer tiden og reagensene. I våre hender var vi i stand til å vaske og gjenbruke flytceller for en av tre sekvenseringskjøringer, slik at ytterligere 55 prøver kunne sekvenseres. Vasking av flytcellen umiddelbart etter bruk, eller hvis det ikke var mulig, fjerning av avfallsvæsken fra avfallskanalen etter hver kjøring, syntes å bevare antall porer tilgjengelig for en andre kjøring. Med tanke på det opprinnelige antallet porer som er tilgjengelige i en flytcelle, kan en kjøring også optimaliseres for å planlegge hvor mange prøver som skal kjøres i en bestemt flytcelle.
Selv om arbeidsflyten har som mål å være så omfattende som mulig, med tillegg av detaljert veiledning og skiltede ressurser, er prosedyren fortsatt kompleks og kan være skremmende for en ny bruker. Brukeren oppfordres til å søke personlig opplæring og støtte, ideelt lokalt, eller alternativt gjennom eksterne samarbeidspartnere. På Filippinene har for eksempel et prosjekt om kapasitetsbygging i regionale laboratorier for SARS-CoV-2 genomisk overvåking ved hjelp av ONT utviklet kjernekompetanse blant helsepersonell som er lett overførbare til RABV-sekvensering. Viktige trinn, for eksempel opprydding av PRI-perler, kan være vanskelige å mestre uten praktisk trening, og ineffektiv opprydding kan skade flytcellen og kompromittere løpet. Prøvekontaminering er alltid et stort problem når amplicons behandles i laboratoriet og kan være vanskelig å eliminere. Spesielt er krysskontaminering mellom prøver ekstremt vanskelig å oppdage under bioinformatikk etter kjøring. God laboratorieteknikk og praksis, som å opprettholde rene arbeidsflater, skille pre- og post-PCR-områder og innlemme negative kontroller, er avgjørende for å sikre kvalitetskontroll. Det raske tempoet i utviklingen av nanoporesekvensering er både en fordel og ulempe for rutinemessig RABV-genomisk overvåking. Fortsatte forbedringer av nanopores nøyaktighet, tilgjengelighet og protokollrepertoar utvider og forbedrer omfanget for applikasjonen. Den samme utviklingen gjør det imidlertid utfordrende å opprettholde standard driftsprosedyrer og bioinformatiske rørledninger. I denne protokollen gir vi et dokument som hjelper overgangen fra eldre til nåværende nanopore bibliotekforberedelsessett (Table of Materials).
En vanlig hindring for sekvensering i LMICs er tilgjengelighet, inkludert ikke bare kostnadene, men også muligheten til å anskaffe forbruksvarer i tide (spesielt sekvenseringsreagenser, som er relativt nye for innkjøpsteam og leverandører) og beregningsressurser, samt ganske enkelt å ha tilgang til stabil strøm og internett. Bruk av bærbar nanopore sekvenseringsteknologi som grunnlag for denne arbeidsflyten hjelper med mange av disse tilgjengelighetsproblemene, og vi har demonstrert bruken av protokollen vår på tvers av en rekke innstillinger, og gjennomfører hele protokollen og analysen i landet. Riktignok er det fortsatt en utfordring å anskaffe utstyr og sekvensere forbruksvarer i tide, og i mange tilfeller ble vi tvunget til å frakte eller sende reagenser fra Storbritannia. I noen områder var vi imidlertid i stand til å stole helt på lokale forsyningsruter for reagenser, og dra nytte av investeringer i SARS-CoV-2-sekvensering (f.eks. Filippinene) som har strømlinjeformet anskaffelsesprosesser og begynt å normalisere anvendelsen av patogengenomikk.
Behovet for en stabil internettforbindelse minimeres av engangsinstallasjoner; for eksempel krever GitHub-depoter, nedlasting av programvare og nanopore-sekvensering i seg selv bare internettilgang for å starte kjøringen (ikke hele) eller kan utføres helt offline etter avtale fra selskapet. Hvis mobildata er tilgjengelig, kan en telefon brukes som et hotspot til den bærbare datamaskinen for å starte sekvenseringskjøringen, før du kobler fra for kjørevarigheten. Ved rutinemessig behandling av prøver kan kravene til datalagring vokse raskt, og ideelt sett vil data lagres på en server. Ellers er solid state drive (SSD) harddisker relativt billige å kilde.
Selv om vi erkjenner at det fortsatt er barrierer for genomisk overvåking i LMICs, øker investeringen i å bygge genomikk tilgjengelighet og kompetanse (f.eks. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 antyder at denne situasjonen vil bli bedre. Genomisk overvåking er kritisk for pandemiberedskap6, og kapasitet kan etableres gjennom rutinisering av genomisk overvåking av endemiske patogener som RABV. Globale forskjeller i sekvenseringskapasiteter fremhevet under SARS-CoV-2-pandemien bør være en driver for katalytisk endring for å takle disse strukturelle ulikhetene.
Denne arbeidsflyten fra prøve til sekvens til tolkning for RABV, inkludert tilgjengelige bioinformatikkverktøy, har potensial til å bli brukt til å veilede kontrolltiltak rettet mot målet om null menneskelige dødsfall fra hundemediert rabies innen 2030, og til slutt for eliminering av RABV-varianter. Kombinert med relevante metadata muliggjør genomiske data generert fra denne protokollen rask RABV-karakterisering under utbruddsundersøkelser og ved identifisering av sirkulerende linjer i et land eller en region60,61,65. Vi illustrerer rørledningen vår for det meste ved hjelp av eksempler fra hundemediert rabies; Arbeidsflyten er imidlertid direkte anvendelig for rabies i dyrelivet. Denne overførbarheten og lave kostnadene minimerer utfordringene med å gjøre rutinemessig sekvensering lett tilgjengelig, ikke bare for rabies, men også for andre patogener46,66,67, for å forbedre sykdomsbehandling og kontroll.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-finansiering fra Medical Research Council [MR/R025649/1] og Philippines Department of Science and Technology (DOST), Storbritannias forsknings- og innovasjonsglobale innsats på COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], og International Partnership Development Fund, et DOST British Council-Filippinene studentskap (CB), et nasjonalt institutt for helseforskning [17/63/82] GemVi-stipend (GJ) og University of Glasgow studentships fra MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP / T517896/1] og Wellcome IIB DTP (HF) [218518 / Z / 19 / Z]. Vi er takknemlige for kolleger og samarbeidspartnere som har støttet dette arbeidet: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana og Anna Czupryna.
Brand name | |||
Software | |||
Sequencing software (MinKnow) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/downloads | |
Bioinformatics tool kit (Guppy) |
Oxford Nanopore Technologies | https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018 | |
Equipment | |||
Thermal cycler (miniPCR™ mini16 thermal cycler) |
Cambio | MP-QP-1016-01 | |
Homogenizer (Precellys Evolution Touch Homogenizer) |
Bertin Instruments | EQ02520-300 | |
Cold Racks (0.2-0.5mL) (PCR Mini-cooler with transparent lid) |
BRAND | 781260 | |
Pipettor | |||
(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL) | Gilson | SKU: FA10030 | |
(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL) | Gilson | SKU: FA10024 | |
(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL) | Gilson | SKU: FA10020 | |
(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL) | Gilson | SKU: FA10025 | |
(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL) | Gilson | SKU: FA10021 | |
(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL) | Gilson | SKU: FA10026 | |
Fluorometer (Qubit 4 Fluorometer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q33238 | |
Laptop (Any brand with ~2 GB of drive space, minimum of 512 GB storage space, msi installer [GPU]) |
|||
Microcentrifuge (Refrigerated centrifuge) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 75004081 | |
Vortex mixer (Basic vortex mixer) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 88882011 | |
Magnetic rack (DynaMag -2 Magnet) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 12321D | |
Sequencing device (MinION) |
Oxford Nanopore Technologies | MinION Mk1B | |
RNA Extraction | |||
RNA extraction kit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250) |
Qiagen | 74106 | |
RNA stabilizing reagents | |||
(RNA later) | Invitrogen | AM7020 | |
(DNA/RNA Shield) | Zymo Research | R1100-50 | |
PCR | |||
Nuclease-free Water (Nuclease-free Water [not DEPC-treated]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | AM9937 | |
Master mix for first strand cDNA synthesis (LunaScript RT SuperMix Kit) |
New England Biolabs | E3010S | |
DNA amplification master mix (Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB]) |
New England Biolabs | M0494L | |
Primer (Scheme) (Custom DNA oligos) |
Invitrogen | ||
SPRI Bead Clean-up | |||
SPRI beads (Aline Biosciences PCR Clean DX ) |
Cambio | AL-AC1003-50 | |
Ethanol, Pure Absolute, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen] | Merck | 818760 | |
Short Fragment buffer (SFB expansion pack) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-SFB001 | |
DNA Quantification | |||
DNA quantification kit (Qubit® dsDNA HS Assay Kit) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32854 | |
DNA quantification assay tubes (Qubit™ Assay Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | Q32856 | |
End Prep and barcoding (Qubit™ Assay Tubes) |
|||
End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module) |
New England Biolabs | E7546L | |
Barcoding kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 | |
(Native Barcoding Expansion 1-12) | EXP-NBD104 | ||
(Native Barcoding Expansion 13-24) | EXP-NBD114 | ||
(Native Barcoding Expansion 96) | EXP-NBD196 | ||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 | |
(not compatible) | (not compatible) | ||
(Native Barcoding Kit 24 V14) | SQK-NBD114.24 | ||
(Native Barcoding Kit 96 V14) | SQK-NBD114.96 | ||
Ligation mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix) |
New England Biolabs | M0367S | |
Adapter Ligation | |||
Adapter ligation master mix | |||
(NEBNext Quick Ligation Module) | New England Biolabs | E6056S | |
(NEBNext Ultra II Ligation Module) | New England Biolabs | E7595S | |
(Blunt/TA Ligase Master Mix) | New England Biolabs | M0367S | |
Adapter mix | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-AMII001 |
|
(Adapter Mix II [AMII]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-NBA114 |
|
(Native adapter [NA]) | |||
Sequencing | |||
Flowcell priming kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 EXP-FLP002 |
|
(Flush Buffer [FB]) | |||
(Flush Tether [FT]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 EXP-FLP004 |
|
(Flow Cell Flush [FCF]) | |||
(Flow Cell Tether [FCT]) | |||
Ligation Sequencing Kit | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 SQK-LSK109 |
|
Adapter Mix (Adapter Mix [AMX]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SQB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LB]) |
|||
Sequencing Tether (Sequencing Tether [SQT]) |
|||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 SQK-LSK114 |
|
Adapter Mix (Ligation Adapter [LA]) |
|||
Ligation Buffer (Ligation buffer [LNB]) |
|||
Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB]) |
|||
Sequencing Buffer (Sequencing Buffer [SB]) |
|||
Elution Buffer (Elution buffer [EB]) |
|||
Loading Beads (Loading Beads [LIB]) |
|||
Sequencing Tether (Flow Cell Tether [FCT]) |
|||
Library solution (Library solution [LIS]) |
|||
Flush buffer (Flow Cell Flush [FCF]) |
|||
Flow Cell | |||
*Chemistry 9 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 9 FLO-MIN106D |
|
(Flow Cell [R9.4.1]) | |||
*Chemistry 14 | Oxford Nanopore Technologies | *Chemistry 14 FLO-MIN114 |
|
(Flow Cell [R10.4.1]) | |||
Flow Cell wash | |||
Flowcell wash kit (Flow cell wash kit) |
Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | |
Consummables | |||
Surface decontaminant | |||
(DNA Away Surface Decontaminant, Squeeze Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7010PK | |
(RNase Away Surface Decontaminant, Bottle [Molecular Bio]) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 7002PK | |
PCR 8-Tube Strip 0.2ml, individual cap (PCR 8-Tube Strip 0.2ml, with Individual attached Flat Caps, Sterile, DNAse/RNAse, Pyrogen Free,Natural [Greiner]) |
Greiner | 608281 | |
PCR Tube 0.2ml (PCR Tube 0.2ml, Natural [Domed Cap] Bagged in 500s, Non-Sterile [Greiner]) |
Greiner | 671201 | |
1000µL Filter Tips (500) (Stacked 1000µL Filter Tips [500]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11977724 | |
100µL Filter Tips (1000) | Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11947724 | |
10µL Filter Tips (1000) (Stacked 100µL Filter Tips [1000]) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 11907724 | |
Reinforced tubes tubes (2ml) with screw caps and o-rings (Fisherbrand™ Bulk tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 15545809 | |
Microcentrifuge tube (1.5ml) (1.5 ml Eppendorf Tubes [500]) |
Eppendorf | 1229888 | |
DNA LoBind Tubes (1.5ml) (DNA LoBind Tubes) |
Thermofisher scientific/Fisher scientific | 10051232 | |
Cryobabies labels | |||
Gloves (S/M/L) | |||
Paper towel |