실험적 자가면역 뇌척수염 동안 자가항원의 면역원성을 향상시키는 Mycobacterium paratuberculosis 의 보조 활성

Summary

여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)_35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 불활성화된 결핵균을 함유하는 완전 프로인트 보조제 (CFA)에서 유화된 MOG 펩티드에 의한 면역화를 필요로 한다. 마이코박테리움의 항원 성분은 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 자극하여 톨 유사 수용체를 통해 Th1 반응을 촉진하는 사이토카인을 생성합니다. 그러므로, 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리아의 양 및 종은 EAE의 발달과 직접적으로 관련된다. 이 방법 논문은 열-사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis 균주 K-10을 함유하는 변형된 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 EAE를 유도하는 대안적인 프로토콜을 제시한다.

Mycobacterium avium 복합체의 구성원인 M. paratuberculosis는 반추 동물에서 요네병의 원인 물질이며 다발성 경화증을 포함한 여러 인간 T 세포 매개 장애의 위험 인자로 확인되었습니다. 전반적으로, Mycobacterium paratuberculosis로 면역화 된 마우스는 동일한 용량의 M. tuberculosis H37Ra를 함유 한 CFA로 예방 접종 된 마우스보다 조기 발병 및 더 큰 질병 중증도를 보였다. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) 균주 K-10의 항원 결정인자는 훨씬 더 많은 수의 T-림프구(CD4+ CD27+), 수지상 세포(CD11c+ IA/I-E+) 및 단핵구(CD11b+ CD115⁺) CFA로 면역화 된 마우스와 비교하여 비장에서. 또한, MOG 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응은 M. paratuberculosis-면역화된 마우스에서 가장 높은 것으로 나타났다. 제형 중의 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제에서 유화된 뇌파리토겐 (예를 들어, MOG_35-55)의 사용은 EAE의 유도 단계 동안 미엘린 에피토프-특이적 CD4⁺ T-세포를 프라이밍하기 위한 수지상 세포를 활성화시키기 위한 대안적이고 검증된 방법일 수 있다.

Introduction

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 장애 연구를 위한 일반적인 모델이다¹. EAE의 몇몇 모델들이 존재한다: 강력한 보조제와 조합된 상이한 미엘린 펩티드를 사용하는 능동 면역화, 미엘린-특이적 CD4⁺ 림프구의 시험관내 전달에 의한 수동 면역화, 및 자발적^EAE2의 트랜스제닉 모델. 이들 모델 각각은 발병기, 이펙터 단계 또는 만성 단계와 같은 EAE의 상이한 양태가 연구될 수 있도록 하는 특정 특징을 갖는다. EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 모델은 단핵 염증 침윤, 말초 백질에서의 탈수초화, 및 질환 피크¹ 후 회복 감소를 특징으로 하기 때문에 만성 신경염증 및 탈수초화의 면역 매개 메커니즘을 연구하기에 좋은 모델이다.

MOG-EAE는 완전한 프로인트 보조제(CFA)에서 펩티드 MOG_35-55 로 감수성 마우스를 면역화한 후, 백일해 독소를 복강내 주사함으로써 유도된다. 이것은 혈액뇌장벽의 투과성을 증가시키고 말초에서 활성화된 미엘린 특이적 T-세포가 중추신경계(CNS)에 도달하여 재활성화되도록 한다

Protocol

모든 마우스 실험은 쥰텐도대학교 의과대학 제도적 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 290238)의 승인을 받았으며, 국립 보건원 동물 실험 가이드라인에 따라 수행되었습니다.

1. 실험에 대한 일반적인 의견

1. 50% ± 10% 습도로 23°C ± 2°C에서 통제되고 병원균이 없는 조건에서 동물 시설의 개별 케이지에 마우스를 수용하고 음식과 물에 대한 임의로 접근할 수 있는 12시간의 명암 주기.
2. 항원과 CFA가 없는 인산염 완충 식염수(PBS)를 마우스에 주사하고 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용합니다.

2. 마이코박테리아 항원의 제조

1. 10% OADC(올레산, 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제), 0.005% 트윈 80 및 2mg/L의 마이코박틴 J가 풍부한 미들브룩 액체 배지 7H9에서 M. paratuberculosis K-10 균주를 37°C의 T25 조직 배양 플라스크에서 2주 동안 성장시킵니다. 육안 검사를 통해 정기적으로 식민지 성장을 평가하십시오.
   주의 : 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 시설에서 M. par....

Results

C57BL/6 마우스 그룹(총 n = 15/그룹)을 M. paratuberculosis를 포함하는 에멀젼에서 또는 CFA를 사용한 일반적인 방법으로 MOG_35-55로 면역화했습니다. 모든 그룹의 마우스는 14-17 일에 관찰 된 단일 피크의 장애를 특징으로하는 급성 단상 질환을 나타 냈으며, 이후 10 일 동안 증상이 부분적으로 회복되었습니다 (그림 1A). 성별에 관계없이 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제로 면역화된 마우스는 CFA로 면역화된 마우스보다 면역화 후 8일에서 9일 사이에 더 일찍 발병하고 급성기에서 더 큰 중증도를 보였다(그림 1B). 그룹 간에 체중에 유의한 차이는 없었다(그림 1C). EAE 마우스로부터의 비장 세포의 세포.......

Discussion

본 발명자들은 M. paratuberculosis¹⁰을 함유하는 보조제에서 에멀젼화된 펩티드 MOG_35-55를 사용하여 C57BL/6J 마우스에서 중증 EAE를 능동적으로 유도하는 강력한 대안 프로토콜을 입증하였다. 이 방법에 의한 EAE의 유도는 CFA와의 일반적인 프로토콜에 의해 유도된 것보다 더 심각한 질환을 초래하였다. 이 차이는 마이코박테리아¹¹의 세포벽에 있는 다른 지질 성분 때문일 수 있습니다. 사실, 다른 마이코박테리아와 달리, M. paratuberculosis는 세포벽 표면에 글리코펩티도리피드 대신 리포펜타펩타이드 항원을 생성한다¹¹. 이 리포펜타펩타이드는 밀접하게 관련된 다른 종과 교차 반응하지 않았으며, 자가면역 질환 환자에서 강력한 특이적 체액성 반응의 표적이 되는 것으로 나타났다¹²........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
안티 마우스 CD115 항체	Biolegend, 미국	135505	세포 형광 측정 1:1,000
안티 마우스 CD11b 항체	Biolegend, 미국	101215	세포 형광 측정 1:1,000
안티 마우스 CD11c 항체	Biolegend, 미국	117313	세포 형광 측정 1:1,000
안티 마우스 CD16/32  항체	Biolegend, 미국	101302	세포형광측정 1:1,000
안티-마우스 CD4  항체	Biolegend, 미국	116004	세포형광분석 1:1,000
안티-마우스 CD8a  항체	Biolegend, 미국	100753	세포형광측정 1:1,000
안티-마우스 I-A/I-E 항체	Biolegend, 미국	107635	세포형광분석 1:1,000
안티-마우스 Ly-6C  항체	Biolegend, 미국		세포 형광 측정을 위한 128023 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, 미국	의 분리 및 배양을 위한	BD 211886
	Charles River Laboratory, 일본		3주 령, 수컷 및 암컷
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, 미국	42F9155K	, 37°C에서 따뜻함; C 사용 전
동결 건조기 기계	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund' s 보조제	Difco Laboratories, MD, USA	263810	보조제
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	소 기원의 박테리아
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, 건조	BD Biosciences, USA	743-26880-EA
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		성장 촉진제
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	뇌경화 펩타이드
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	음성 대조군 항원  증식 분석
백일해 독소 용액	Fujifilm Wako, Osaka 일본	168-22471	그람 음성 박테리아 Bordetella pertussi에서 혈액 뇌 장벽 투과성 증가
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica
-글루타민과 보조제 RPMI 1640과	Gibco Life Techologies, 미국	11875093	세포 배양
티미딘, [메틸-3H], 2% 에탄올, 1mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		NET027W001MC 증식 분석, 사용 (1 μ Ci/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, 미국	423105	세포 형광 측정법, 세포 생존율