がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング
Summary
イオンチャネルの薬理学的標的化は、固形腫瘍を治療するための有望なアプローチです。がん細胞におけるイオンチャネル機能を特徴付け、がんの生存率に対するイオンチャネルモジュレーターの効果をアッセイするための詳細なプロトコルが提供されています。
Abstract
イオンチャネルは、細胞の発生と細胞の恒常性の維持に不可欠です。イオンチャネル機能の摂動は、広範囲の障害またはチャネル障害の発症に寄与する。がん細胞は、イオンチャネルを利用して自身の発生を促進し、腫瘍として改善し、さまざまな非がん細胞を含む微小環境に同化します。さらに、腫瘍微小環境内の成長因子およびホルモンのレベルの増加は、イオンチャネル発現の増強をもたらし、癌細胞の増殖および生存に寄与する。したがって、イオンチャネルの薬理学的標的化は、原発性および転移性脳腫瘍を含む固形悪性腫瘍を治療するための有望なアプローチとなる可能性があります。ここでは、癌細胞におけるイオンチャネルの機能を特徴付けるためのプロトコル、および癌生存率への影響を決定するためにイオンチャネルのモジュレーターを分析するためのアプローチについて説明します。これらには、イオンチャネルの細胞の染色、ミトコンドリアの分極状態のテスト、電気生理学を使用したイオンチャネル機能の確立、および薬物効力を評価するための生存率アッセイの実行が含まれます。
Introduction
膜輸送タンパク質は、細胞間のコミュニケーションや細胞の恒常性の維持に不可欠です。膜輸送タンパク質の中で、イオンチャネルは細胞の成長と発達を促進し、困難で変化する環境で細胞の状態を維持するのに役立ちます。イオンチャネルは、全身および中枢神経系(CNS)の両方で固形腫瘍の発生を促進し、サポートすることも報告されています1,2。例えば、KCa3.1チャネルは、膜電位の調節と細胞周期の調節に重要な細胞体積の制御に関与しています。欠陥のあるKCa3.1チャネルは、腫瘍細胞の異常な増殖に寄与することが報告されています3。さらに、イオンチャネルは癌の転移性播種に寄与し得る。一過性受容器電位(TRP)チャネルは、例えば、Ca2+およびMg2+流入に関与している。この流入は、腫瘍を取り囲む細胞外マトリックスを調節するように機能するいくつかのキナーゼとヒートショックタンパク質を活性化し、これは癌転移の開始に重要です4。
イオンチャネルはがんの発症に寄与する可能性があるため、薬物関連のがん治療の標的にもなり得る。例えば、化学療法および新規免疫療法を含む治療法に対する耐性は、イオンチャネル機能調節不全に関連している5,6,7。さらに、イオンチャネルは、がんの成長と発生を妨げる重要な創薬標的として浮上しており、再利用された低分子(FDA承認)薬や、モノクローナル抗体を含む生体高分子が検討されています1,2,8,9。この面では多くの進歩がありましたが、イオンチャネルがんの創薬は未発達のままです。これは、がん細胞のイオンチャネルを研究するという独特の課題に一部起因しています。例えば、遅効性化合物の電気生理学アッセイの設定には技術的な限界があり、チャネル活性化と薬物作用の時間的な違いがあります。さらに、今日一般的に使用されている自動電気生理学システムのほとんどは疎水性基質を利用しているため、化合物の溶解性も進行を妨げる可能性があり、化合物吸着の結果としてアーティファクトに寄与する可能性があります。さらに、天然物、ペプチド、モノクローナル抗体などの大規模な生物有機分子治療薬は、従来の電気生理学アッセイ10を使用してスクリーニングすることが技術的に困難です。最後に、がん細胞の生体電気的特性はよくわかっていません11。
一方、イオンチャネルの免疫蛍光染色はしばしば困難です。これは、部分的には、それらの構造の複雑さと膜内のコンテキストによるものであり、顕微鏡研究のための抗体の生成と使用の両方の能力に影響を与えます。イオンチャネルの染色に使用される抗体が、特異性、親和性、再現性について検証されていることが特に重要です。イオンチャネル用の市販抗体は、その検証戦略と発表記録に基づいて検討する必要があります。実験には、標的タンパク質のノックダウンまたはノックアウトのいずれかによる非特異的結合の欠如を実証するためのネガティブコントロールを含める必要があります。あるいは、標的タンパク質が存在しない、またはmRNAまたはタンパク質の決定に基づいて存在量が少ない細胞株は、ネガティブコントロールとして役立ち得る。例えば、この研究は、髄芽腫細胞株(D283)における(GABA)受容体サブユニットGabra5の局在を示す。siRNAノックダウンを有するD283細胞および別の小脳髄芽腫細胞株であるDaoy細胞をGabra5について染色したが、認識可能な染色は示されなかった(データ示さず)。
ここでは、イオンチャネル機能、ならびに癌細胞に対するイオンチャネルモジュレーターの効果を分析およびアッセイするための方法が提示される。(1)イオンチャネルの細胞の染色、(2)ミトコンドリアの分極状態の検査、(3)電気生理学を用いたイオンチャネル機能の確立、および(4)in vitro薬物検証のためのプロトコルが提供されています。これらのプロトコルは、A型ガンマアミノ酪酸(GABAA)受容体2,12,13,14,15,16、塩化物アニオンチャネルおよび主要な抑制性神経伝達物質受容体の研究を強調しています。ただし、ここで紹介する方法は、他の多くの癌細胞やイオンチャネルの研究に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
イオンチャネル機能の変化は、細胞内シグナル伝達カスケードを変化させ、細胞の全体的な機能に影響を与える可能性があります。過去10年間で、イオンチャネルが癌細胞の成長と転移に重要であることがますます明らかになっています。重要なことに、多くのイオンチャネルは、広範囲の障害を標的とする承認された治療薬の主要な標的である24。研究者らは、イオンチャ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Thomas E. & Pamela M. Mischell Family FoundationからSSへの支援、およびHarold C. Schott FoundationがUC College of MedicineのHarold C. Schott寄付講座からSSへの資金提供を認めている。
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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