Screening av ionekanaler i kreftceller

Summary

Den farmakologiske målrettingen av ionkanaler er en lovende tilnærming til behandling av solide svulster. Detaljerte protokoller er gitt for å karakterisere ionkanalfunksjon i kreftceller og analysere effekten av ionkanalmodulatorer på kreftens levedyktighet.

Abstract

Ionkanaler er kritiske for celleutvikling og opprettholdelse av cellehomeostase. Forstyrrelsen av ionkanalfunksjonen bidrar til utviklingen av et bredt spekter av lidelser eller kanalopatier. Kreftceller bruker ionkanaler for å drive sin egen utvikling, samt å forbedre seg som en svulst og å assimilere i et mikromiljø som inkluderer forskjellige ikke-kreftceller. Videre kan økninger i nivåer av vekstfaktorer og hormoner i tumormikromiljøet resultere i forbedret ionkanaluttrykk, noe som bidrar til kreftcelleproliferasjon og overlevelse. Dermed er den farmakologiske målrettingen av ionkanaler potensielt en lovende tilnærming til behandling av solide maligniteter, inkludert primær og metastatisk hjernekreft. Her beskrives protokoller for å karakterisere funksjonen til ionkanaler i kreftceller og tilnærminger for å analysere modulatorer av ionkanaler for å bestemme deres innvirkning på kreftens levedyktighet. Disse inkluderer farging av en celle (er) for en ionkanal (er), testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og utførelse av levedyktighetsanalyser for å vurdere stoffets styrke.

Introduction

Membrantransportproteiner er kritiske for kommunikasjon mellom celler, samt for å opprettholde cellulær homeostase. Blant membrantransportproteinene tjener ionkanaler til å drive vekst og utvikling av celler og for å opprettholde tilstanden til celler i utfordrende og skiftende miljøer. Ionekanaler har også blitt rapportert å drive og støtte utviklingen av solide svulster, både systemisk og i sentralnervesystemet (CNS)^1,2. For eksempel er KCa3.1-kanaler ansvarlige for å regulere membranpotensialet og kontrollere cellevolumet, noe som er viktig i cellesyklusregulering. Defekte KCa3.1-kanaler har blitt rapportert å bidra til unormal spredning av tumorceller³. Videre kan ionekanaler bidra til metastatisk spredning av kreft. Transient receptor potential (TRP) kanaler, for eksempel, er involvert i Ca 2+ og Mg²⁺ tilstrømning; Denne tilstrømningen aktiverer flere kinaser og varmesjokkproteiner som fungerer for å regulere den ekstracellulære matrisen rundt en svulst, noe som igjen er viktig for å initiere kreftmetastase⁴.

Siden ionekanaler kan bidra til utvikling av kreft, kan de også være mål for legemiddelrelatert kreftbehandling. For eksempel er resistens mot behandlingsmodaliteter, inkludert kjemoterapi og ny immunterapi, relatert til dysregulering av ionkanalfunksjon ^5,6,7. I tillegg fremstår ionkanaler som viktige legemiddelmål for å hindre vekst og utvikling av kreft, med repurposed small molecule (FDA-godkjente) legemidler som undersøkes, samt biopolymerer, inkludert monoklonale antistoffer 1,2,8,9. Mens det har vært mye fremgang på denne fronten, er ionkanal kreftmedisinoppdagelse fortsatt underutviklet. Dette skyldes delvis de unike utfordringene ved å studere ionekanaler i kreftceller. For eksempel er det tekniske begrensninger i å sette opp elektrofysiologianalyser for langsomvirkende forbindelser og tidsmessige forskjeller i kanalaktivering og medikamentvirkning. Videre kan løseligheten av forbindelser også hindre fremgang, da de fleste av de automatiserte elektrofysiologisystemene som vanligvis brukes i dag, bruker hydrofobe substrater, noe som kan bidra til artefakter som følge av sammensatt adsorpsjon. I tillegg er store bioorganiske molekylære terapier som naturlige produkter, peptider og monoklonale antistoffer teknisk utfordrende å screene ved hjelp av konvensjonelle elektrofysiologianalyser¹⁰. Endelig forblir de bioelektriske egenskapene til kreftceller dårlig forstått¹¹.

I mellomtiden er immunfluorescensfarging av ionkanaler ofte utfordrende. Dette skyldes delvis kompleksiteten i deres strukturer og deres kontekst i membranen, noe som påvirker evnen til både å generere og anvende antistoffer for mikroskopistudier. Det er spesielt viktig at antistoffene som brukes til å flekke ionekanaler er validert for spesifisitet, affinitet og reproduserbarhet. Kommersielle antistoffer for ionekanaler bør vurderes basert på deres valideringsstrategi og publikasjonsrekord. Eksperimenter bør inkludere negative kontroller for å demonstrere mangelen på uspesifikk binding ved enten knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellelinjer der målproteinet er fraværende eller i lav overflod basert på mRNA- eller proteinbestemmelser, tjene som negative kontroller. For eksempel viser denne studien lokaliseringen av (GABA) reseptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellelinje (D283). D283-celler med siRNA-knockdown og Daoy-celler, en annen cerebellar medulloblastomcellelinje, ble farget for Gabra5 og viste ingen nevneverdig farging (data ikke vist).

Her presenteres metoder for å analysere og analysere ionkanalfunksjonen, samt effekten av ionkanalmodulatorer på kreftceller. Protokoller er gitt for (1) fargeceller for en ionkanal, (2) testing av den polariserte tilstanden til mitokondrier, (3) etablering av ionkanalfunksjon ved hjelp av elektrofysiologi og (4) in vitro legemiddelvalidering. Disse protokollene legger vekt på studier av type A gamma-aminosmørsyre (GABA_A) reseptor 2,12,13,14,15,16^, en kloridanionkanal og viktig hemmende nevrotransmitterreseptor. Metodene som presenteres her gjelder imidlertid for å studere mange andre kreftceller og ionekanaler.

Protocol

1. Immunmerking ionkanaler i dyrkede celler Klargjøring av cellene og eksperimentelt oppsettOpprettholde cellene som en aktivt voksende kultur i 75 cm2 kulturflasker. Pass cellene en gang til de blir 50% -90% sammenflytende, avhengig av doblingstiden til cellelinjen som brukes.MERK: For denne studien ble D283-celler, en gruppe 3-medulloblastomcellelinje, brukt. Samle cellene fra kulturkolben inn i et sentrifugerør (15 ml eller 50 ml), og tilsett 2 ml 0,25% trypsin-EDTA for å…

Representative Results

Ovenfor er utvalgte prosedyrer som kan brukes til å karakterisere ionkanaler i kreftceller. Den første protokollen fremhever fargingen av en ionkanal. Som beskrevet er det mange utfordringer når du farger en ionkanal eller for den saks skyld noe protein som er tilstede i den ekstracellulære membranen. Vist i figur 1 er fargingen for en underenhet av den pentameriske GABA A-reseptoren. Den andre protokollen fremhever resultatene av å teste den polariserte tilstanden til mitoko…

Discussion

Endringer i ionkanalfunksjonen endrer intracellulære signalkaskader, noe som kan påvirke den generelle funksjonen til en celle. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at ionkanaler er viktige for kreftcellevekst og metastase. Det er viktig at mange ionkanaler er primære mål for godkjente terapier rettet mot et bredt spekter av lidelser²⁴. Etterforskere har undersøkt om ionkanaler kan være anti-kreftmål, og de første resultatene er lovende ^{2,16,25</s…}

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS – Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841