Den farmakologiska inriktningen av jonkanaler är ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida tumörer. Detaljerade protokoll tillhandahålls för att karakterisera jonkanalfunktionen i cancerceller och analysera effekterna av jonkanalmodulatorer på cancerlivskraft.
Jonkanaler är avgörande för cellutveckling och upprätthållande av cellhomeostas. Störningen av jonkanalfunktionen bidrar till utvecklingen av ett brett spektrum av störningar eller kanalopatier. Cancerceller använder jonkanaler för att driva sin egen utveckling, samt att förbättra sig som tumör och att assimilera i en mikromiljö som inkluderar olika icke-cancerceller. Dessutom kan ökningar av nivåer av tillväxtfaktorer och hormoner inom tumörmikromiljön resultera i förbättrat jonkanaluttryck, vilket bidrar till cancercellsproliferation och överlevnad. Således är farmakologisk inriktning av jonkanaler potentiellt ett lovande tillvägagångssätt för behandling av solida maligniteter, inklusive primär och metastaserad hjärncancer. Här beskrivs protokoll för att karakterisera funktionen av jonkanaler i cancerceller och metoder för att analysera modulatorer av jonkanaler för att bestämma deras inverkan på cancerlivskraft. Dessa inkluderar färgning av en cell (er) för en jonkanal (er), testning av det polariserade tillståndet hos mitokondrier, etablering av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och utförande av livskraftsanalyser för att bedöma läkemedelsstyrka.
Membrantransportproteiner är avgörande för kommunikation mellan celler, liksom för att upprätthålla cellulär homeostas. Bland membrantransportproteinerna tjänar jonkanaler till att driva tillväxt och utveckling av celler och för att upprätthålla cellernas tillstånd i utmanande och föränderliga miljöer. Jonkanaler har också rapporterats driva och stödja utvecklingen av solida tumörer, både systemiskt och i centrala nervsystemet (CNS)1,2. Till exempel är KCa3.1-kanaler ansvariga för att reglera membranpotentialen och kontrollera cellvolymen, vilket är viktigt vid cellcykelreglering. Defekta KCa3.1-kanaler har rapporterats bidra till onormal spridning av tumörceller3. Vidare kan jonkanaler bidra till metastaserad spridning av cancer. Övergående receptorpotential (TRP) kanaler är till exempel involverade i Ca 2+ och Mg2+ tillströmning; Denna tillströmning aktiverar flera kinaser och värmechockproteiner som fungerar för att reglera den extracellulära matrisen som omger en tumör, vilket i sin tur är viktigt för att initiera cancermetastaser4.
Eftersom jonkanaler kan bidra till utvecklingen av cancer kan de också vara måltavlor för läkemedelsrelaterad cancerbehandling. Till exempel är resistens mot behandlingsmodaliteter, inklusive kemoterapi och ny immunterapi, relaterad till jonkanalfunktionsdysregulering 5,6,7. Dessutom framträder jonkanaler som viktiga läkemedelsmål för att hindra tillväxt och utveckling av cancer, med återanvända småmolekylära (FDA-godkända) läkemedel som undersöks, liksom biopolymerer, inklusive monoklonala antikroppar 1,2,8,9. Även om det har skett stora framsteg på denna front, är jonkanalcancerläkemedelsupptäckten fortfarande underutvecklad. Detta beror delvis på de unika utmaningarna med att studera jonkanaler i cancerceller. Till exempel finns det tekniska begränsningar vid upprättandet av elektrofysiologiska analyser för långsamt verkande föreningar och tidsmässiga skillnader i kanalaktivering och läkemedelsverkan. Vidare kan lösligheten hos föreningar också hindra framsteg, eftersom de flesta av de automatiserade elektrofysiologiska system som vanligtvis används idag använder hydrofoba substrat, vilket kan bidra till artefakter som ett resultat av sammansatt adsorption. Dessutom är stora bioorganiska molekylära terapier som naturprodukter, peptider och monoklonala antikroppar tekniskt utmanande att screena med konventionella elektrofysiologiska analyser10. Slutligen förblir cancercellernas bioelektriska egenskaper dåligt förstådda11.
Samtidigt är immunofluorescensfärgning av jonkanaler ofta utmanande. Detta beror delvis på komplexiteten i deras strukturer och deras sammanhang i membranet, vilket påverkar förmågan att både generera och använda antikroppar för mikroskopistudier. Det är särskilt viktigt att antikropparna som används för att färga jonkanaler valideras för specificitet, affinitet och reproducerbarhet. Kommersiella antikroppar för jonkanaler bör övervägas baserat på deras valideringsstrategi och publikationsrekord. Experiment bör innehålla negativa kontroller för att visa bristen på ospecifik bindning genom antingen knockdown eller knockout av målproteinet. Alternativt kan cellinjer i vilka målproteinet saknas eller är i låg förekomst baserat på mRNA- eller proteinbestämningar fungera som negativa kontroller. Till exempel visar denna studie lokaliseringen av (GABA) receptorunderenheten Gabra5 i en medulloblastomcellinje (D283). D283-celler med en siRNA-knockdown och Daoy-celler, en annan cerebellär medulloblastomcellinje, färgades för Gabra5 och visade ingen märkbar färgning (data visas inte).
Här presenteras metoder för att analysera och analysera jonkanalfunktion, samt effekten av jonkanalmodulatorer på cancerceller. Protokoll tillhandahålls för (1) färgning av celler för en jonkanal, (2) testning av mitokondriernas polariserade tillstånd, (3) upprättande av jonkanalfunktion med hjälp av elektrofysiologi och (4) in vitro-läkemedelsvalidering. Dessa protokoll betonar studier av typ A gamma-aminosmörsyra (GABAA) receptor 2,12,13,14,15,16, en kloridanjonkanal och större hämmande neurotransmittorreceptor. De metoder som presenteras här gäller dock för att studera många andra cancerceller och jonkanaler.
Förändringar i jonkanalfunktionen förändrar intracellulära signalkaskader, vilket kan påverka cellens övergripande funktion. Under det senaste decenniet har det blivit allt tydligare att jonkanaler är viktiga för cancercellstillväxt och metastasering. Viktigt är att många jonkanaler är primära mål för godkända terapier som riktar sig mot ett brett spektrum av störningar24. Utredare har undersökt om jonkanaler kan vara anti-cancermål, och de första resultaten lovar <sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner stöd från Thomas E. &; Pamela M. Mischell Family Foundation till SS och Harold C. Schott Foundation-finansiering av Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, till SS
ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
FCCP | Abcam | AB120081 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
Heparin | STEMCELL | 7980 | |
HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
Nest-O-Patch | Heka | ||
Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
PATHCHMASTER | Heka | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
PFA | EMS | RT-15710 | |
Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
Prism | GraphPad | ||
Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |