Genetisk profilering og genom-skala dropout screening for at identificere terapeutiske mål i musemodeller af ondartet perifer nerveskede tumor

Summary

Vi har udviklet en komparativ onkogenomisk tilgang på tværs af arter ved hjælp af genomiske analyser og funktionelle genomiske screeninger til at identificere og sammenligne terapeutiske mål i tumorer, der opstår i genetisk manipulerede musemodeller og den tilsvarende humane tumortype.

Abstract

Maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST’er) er afledt af Schwann-celler eller deres forstadier. Hos patienter med tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1) er MPNST’er den mest almindelige malignitet og den største dødsårsag. Disse sjældne og aggressive bløddelssarkomer tilbyder en skarp fremtid med 5-årige sygdomsfrie overlevelsesrater på 34-60%. Behandlingsmuligheder for personer med MPNST’er er skuffende begrænsede, hvor skæmmende kirurgi er den vigtigste behandlingsmulighed. Mange engang lovende terapier såsom tipifarnib, en hæmmer af Ras-signalering, har fejlet klinisk. Ligeledes har kliniske fase II-forsøg med erlotinib, som er rettet mod den epidermale vækstfaktor (EFGR), og sorafenib, som er rettet mod den vaskulære endotelvækstfaktorreceptor (VEGF), blodpladeafledte vækstfaktorreceptor (PDGF) og Raf, i kombination med standard kemoterapi, heller ikke givet respons hos patienter.

I de senere år har funktionelle genomiske screeningsmetoder kombineret med genetisk profilering af kræftcellelinjer vist sig nyttige til at identificere essentielle cytoplasmatiske signalveje og udvikling af målspecifikke terapier. I tilfælde af sjældne tumortyper anvendes en variation af denne tilgang kendt som komparativ oncogenomics på tværs af arter i stigende grad til at identificere nye terapeutiske mål. I krydsartskomparativ onkogenomik udføres genetisk profilering og funktionel genomforskning i genetisk manipulerede musemodeller (GEM), og resultaterne valideres derefter i de sjældne humane prøver og cellelinjer, der er tilgængelige.

Dette papir beskriver, hvordan man identificerer kandidatdrivergenmutationer i MPNST-celler fra mennesker og mus ved hjælp af heleksomsekventering (WES). Vi beskriver derefter, hvordan man udfører genomskala shRNA-skærme for at identificere og sammenligne kritiske signalveje i mus og humane MPNST-celler og identificere lægemiddelbare mål i disse veje. Disse metoder giver en effektiv tilgang til at identificere nye terapeutiske mål i en række humane kræftformer.

Introduction

Maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST’er) er meget aggressive spindelcelleneoplasmer, der opstår i forbindelse med tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1), sporadisk i den generelle befolkning og på steder med tidligere strålebehandling ^1,2,3. NF1-patienter fødes med en vildtypekopi af NF1-tumorsuppressorgenet og en anden NF1-allel med en funktionstabsmutation. Denne tilstand af haploinsufficiens gør NF1-patienter modtagelige for en anden tab-af-funktion-mutation i deres vildtype NF1-gen, som udløser tumorgenese. Når denne “anden hit” NF1-mutation forekommer i en celle i Schwann-celleafstamningen, er den resulterende tumor enten et dermalt neurofibroma, der opstår i huden eller et plexiform neurofibroma, der udvikler sig i store nerver eller nerveplexuser. Selvom patologien af dermale og plexiforme neurofibromer er identisk, er deres biologiske adfærd helt anderledes – selvom både dermale og plexiforme neurofibromer er godartede, kan kun plexiforme neurofibromer gennemgå transformation og give anledning til MPNST’er. Ud over tabet af neurofibromin, det Ras GTPase-aktiverende protein kodet af NF1-genet, bærer MPNST’er mutationer af flere andre tumorsuppressorgener, herunder TP53 4,5,6,7, CDKN2A ^8,9 og PTEN 10, mutationer af gener, der koder for komponenter i polycomb-repressivt kompleks 2 11,12 (PRC2;SUZ12 og EED-gener) og afvigende ekspression af receptortyrosinkinaser ^1,2. Mutationer af NF1 og de andre gener, der er nævnt ovenfor, er også til stede i sporadiske og strålingsinducerede MPNST’er^11,12.

Mens disse fremskridt i vores forståelse af de genomiske abnormiteter i MPNST’er har været uvurderlige for forståelsen af deres patogenese, har de endnu ikke resulteret i udviklingen af effektive nye terapier til MPNST’er. En væsentlig hindring for udviklingen af nye behandlinger er, at MPNST’er er sjældne kræftformer. På grund af dette er det vanskeligt at få det store antal patientprøver, der kræves til globale analyser, der definerer centrale drivermutationer som dem, der foretages af The Cancer Genome Atlas (TCGA). Det er vores erfaring, at det kan tage år at akkumulere selv et beskedent antal MPNST-eksemplarer. For at overvinde sådanne begrænsninger har mange forskere, der studerer andre sjældne kræftformer, henvendt sig til brugen af komparativ oncogenomics på tværs af arter til at identificere essentielle drivergenmutationer, definere de væsentlige cytoplasmatiske signalveje i deres tumor af interesse og identificere nye terapeutiske mål. Da signalveje, der er afgørende for tumorigenese, er stærkt bevaret mellem mennesker og andre hvirveldyrarter, kan anvendelse af funktionelle genomiske tilgange såsom genomskala shRNA-skærme være et effektivt middel til at identificere disse nye drivermutationer, signalveje og terapeutiske mål 13,14,15,16,17,18,19, især når man studerer sjældne humane tumortyper, der er tilgængelige i begrænsende antal²⁰.

I de metoder, der præsenteres her, beskriver vi denne tilgang til udførelse af genomisk profilering i humane MPNST-cellelinjer og MPNST-kulturer med tidlig passage afledt af P 0-GGFβ3-mus, en genetisk manipuleret musemodel (GEM), hvor Schwann-cellespecifik overekspression af vækstfaktorneuregulin-1 (NRG1) fremmer patogenesen af plexiforme neurofibromer og deres efterfølgende progression til MPNST’er^{21, 22,23}. Det første skridt i denne tilgang er at identificere kandidatdrivergener i P 0-GGFβ3 MPNST’er, humane MPNST-cellelinjer og kirurgisk resekterede humane MPNST’er. For funktionelt at validere de signalveje, der påvirkes af disse mutationer, bruger vi derefter shRNA-skærme i genomskala til at identificere de gener, der kræves for spredning og overlevelse i MPNST-cellelinjer hos mennesker og mus. Efter at have identificeret de gener, der kræves for spredning og overlevelse, identificerer vi derefter de medicinerbare genprodukter inden for samlingen af “hits” ved hjælp af Drug Gene Interaction Database. Vi sammenligner også “hits” i MPNST-celler fra mennesker og mus for at afgøre, om GEM-modellen og humane MPNST’er viser lignende afhængighed af de samme gener og signalveje. Identifikation af overlapninger i de gener, der kræves for spredning og overlevelse og de berørte signalveje, tjener som et middel til at validere P 0-GGFβ3-musemodellen på molekylært niveau. Denne tilgang understreger også effektiviteten af at kombinere menneskelige og museskærme for at identificere nye terapeutiske mål, hvor musemodellen kan tjene som et supplement til de menneskelige skærme. Værdien af denne tilgang på tværs af arter er særlig tydelig, når man leder efter terapeutiske mål i sjældne tumorer, hvor humane tumorer og cellelinjer er vanskelige at opnå.

Protocol

Inden undersøgelserne påbegyndes, skal dyreprocedurer og protokoller til håndtering af virale vektorer gennemgås og godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Biosafety Committee (IBC). De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Medical University of South Carolinas IACUC- og IBC-bestyrelser og blev udført af korrekt uddannet personale i overensstemmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institutionelle retningslinjer for dyrepleje. <p…

Representative Results

Figur 5 plots viser udtømningsresultater af kerneessentielle gener (CEG’er) mærket som SAND sammenlignet med ikke-CEG’er (mærket som FALSE) i hver human cellelinje, der blev screenet. Point repræsenterer log2 af foldudtømningsscorer for individuelle gener, som er plottet over en boxplot-repræsentation af den samlede scorefordeling. Elevens t-test blev brugt til at teste for en signifikant forskel i gennemsnittet af udtømningsscore mellem de to grupper i hver cellelinje. De re…

Discussion

De detaljerede metoder, der præsenteres her, blev udviklet til at studere neoplasi i perifert nervesystem og MPNST-patogenese. Selvom vi har fundet disse metoder effektive, skal det erkendes, at der er nogle potentielle begrænsninger for de metoder, vi beskriver her. Nedenfor diskuterer vi nogle af disse begrænsninger og potentielle strategier til at overvinde dem i andre modelsystemer.

Vi har fundet ud af, at hele eksomsekventering effektivt identificerer mutationer af interesse…

Materials

Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org