Genetisk profilering och screening av bortfall i genomskala för att identifiera terapeutiska mål i musmodeller av malign perifer nervskidetumör
Summary
Vi har utvecklat en artöverskridande onkogenomisk metod som använder genomiska analyser och funktionella genomiska screeningar för att identifiera och jämföra terapeutiska mål i tumörer som uppstår i genetiskt modifierade musmodeller och motsvarande humana tumörtyp.
Abstract
Maligna perifera nervskidetumörer (MPNST) härrör från Schwann-celler eller deras föregångare. Hos patienter med tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) är MPNST den vanligaste maligniteten och den vanligaste dödsorsaken. Dessa sällsynta och aggressiva mjukdelssarkom erbjuder en krass framtid, med en 5-årig sjukdomsfri överlevnad på 34-60%. Behandlingsalternativen för personer med MPNST är tyvärr begränsade, med vanprydande kirurgi som det främsta behandlingsalternativet. Många en gång lovande terapier som tipifarnib, en hämmare av Ras-signalering, har misslyckats kliniskt. På samma sätt har kliniska fas II-prövningar med erlotinib, som riktar sig mot den epidermala tillväxtfaktorn (EFGR), och sorafenib, som riktar sig mot den vaskulära endotelial tillväxtfaktorreceptorn (VEGF), trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor (PDGF) och Raf, i kombination med standardkemoterapi, också misslyckats med att ge ett svar hos patienter.
Under de senaste åren har funktionsgenomiska screeningmetoder i kombination med genetisk profilering av cancercellinjer visat sig vara användbara för att identifiera viktiga cytoplasmatiska signalvägar och utveckla målspecifika terapier. När det gäller sällsynta tumörtyper används i allt högre grad en variant av detta tillvägagångssätt som kallas cross-species comparative oncogenomics för att identifiera nya terapeutiska mål. I jämförande onkogenomik mellan arter utförs genetisk profilering och funktionell genomik i genetiskt modifierade musmodeller (GEM) och resultaten valideras sedan i de sällsynta humana prover och cellinjer som finns tillgängliga.
Denna artikel beskriver hur man identifierar kandidatmutationer i MPNST-celler hos människa och mus med hjälp av helexomsekvensering (WES). Vi beskriver sedan hur man utför shRNA-skärmar i genomskala för att identifiera och jämföra kritiska signalvägar i möss och humana MPNST-celler och identifiera läkemedelsbara mål i dessa vägar. Dessa metoder ger ett effektivt tillvägagångssätt för att identifiera nya terapeutiska mål i en mängd olika mänskliga cancertyper.
Introduction
Maligna perifera nervskidetumörer (MPNST) är mycket aggressiva spindelcellstumörer som uppstår i samband med tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1), sporadiskt i den allmänna befolkningen och på platser för tidigare strålbehandling 1,2,3. NF1-patienter föds med en vildtypskopia av NF1-tumörsuppressorgenen och en andra NF1-allel med en mutation som leder till förlust av funktion. Detta tillstånd av haploinsufficiens gör NF1-patienter mottagliga för en andra förlust av funktionsmutation i sin vildtyps-NF1-gen, vilket utlöser tumörbildning. När denna “andra träff” NF1-mutation inträffar i en cell i Schwann-cellinjen, är den resulterande tumören antingen ett dermalt neurofibrom som uppstår i huden eller ett plexiformt neurofibrom som utvecklas i stora nerver eller nervplexus. Även om patologin för dermala och plexiforma neurofibrom är identisk, är deras biologiska beteende ganska olika – även om både dermala och plexiforma neurofibrom är godartade, kan endast plexiforma neurofibrom genomgå transformation och ge upphov till MPNST. Förutom förlusten av neurofibromin, det Ras GTPasaktiverande proteinet som kodas av NF1-genen, bär MPNST på mutationer av flera andra tumörsuppressorgener, inklusive TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 och PTEN 10, mutationer av gener som kodar för komponenter i polycomb-repressivt komplex 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 och EED-gener) och avvikande uttryck av receptortyrosinkinaser 1,2. Mutationer av NF1 och de andra generna som nämns ovan finns också i sporadiska och strålningsinducerade MPNST11,12.
Även om dessa framsteg i vår förståelse av de genomiska abnormiteterna i MPNST har varit ovärderliga för att förstå deras patogenes, har de ännu inte resulterat i utvecklingen av effektiva nya terapier för MPNST. Ett stort hinder för utvecklingen av nya behandlingar är det faktum att MPNST är sällsynta cancerformer. På grund av detta är det svårt att få tag på det stora antal patientprover som krävs för globala analyser som definierar viktiga drivkraftsmutationer som de som utförs av The Cancer Genome Atlas (TCGA). Enligt vår erfarenhet kan det ta flera år att samla på sig även ett blygsamt antal mänskliga MPNST-prover. För att övervinna sådana begränsningar har många forskare som studerar andra sällsynta cancertyper vänt sig till användningen av jämförande onkogenomik mellan arter för att identifiera viktiga drivande genmutationer, definiera de väsentliga cytoplasmatiska signalvägarna i deras tumör av intresse och identifiera nya terapeutiska mål. Eftersom de signalvägar som är viktiga för tumörbildning är mycket bevarade mellan människor och andra ryggradsdjur, kan tillämpning av funktionella genomiska metoder såsom shRNA-skärmar på genomnivå vara ett effektivt sätt att identifiera dessa nya drivkraftsmutationer, signalvägar och terapeutiska mål 13,14,15,16,17,18,19, särskilt när man studerar sällsynta mänskliga tumörtyper som finns i ett begränsat antal20.
I de metoder som presenteras här beskriver vi detta tillvägagångssätt för att utföra genomisk profilering i humana MPNST-cellinjer och MPNST-kulturer med tidig passage härledda från P 0-GGFβ3-möss, en genetiskt modifierad musmodell (GEM) där Schwann-cellspecifikt överuttryck av tillväxtfaktorn neuregulin-1 (NRG1) främjar patogenesen av plexiforma neurofibrom och deras efterföljande progression till MPNSTs 21, 22,23. Det första steget i detta tillvägagångssätt är att identifiera kandidatdrivande gener i P 0-GGFβ3 MPNSTs, humana MPNST-cellinjer och kirurgiskt resekerade humana MPNSTs. För att funktionellt validera de signalvägar som påverkas av dessa mutationer använder vi sedan shRNA-skärmar i genomskala för att identifiera de gener som krävs för proliferation och överlevnad i MPNST-cellinjer hos människa och mus. Efter att ha identifierat de gener som krävs för proliferation och överlevnad identifierar vi sedan de läkemedelsbara genprodukterna i samlingen av “träffar” med hjälp av Drug Gene Interaction Database. Vi jämför också “träffarna” i MPNST-celler hos människa och mus för att avgöra om GEM-modellen och humana MPNST uppvisar liknande beroende av samma gener och signalvägar. Att identifiera överlappningar i de gener som krävs för proliferation och överlevnad och de påverkade signalvägarna fungerar som ett sätt att validera P 0-GGFβ3-musmodellen på molekylär nivå. Detta tillvägagångssätt betonar också effektiviteten av att kombinera human- och musskärmar för att identifiera nya terapeutiska mål, där musmodellen kan fungera som ett komplement till de mänskliga skärmarna. Värdet av detta artöverskridande tillvägagångssätt är särskilt tydligt när man letar efter terapeutiska mål i sällsynta tumörer, där mänskliga tumörer och cellinjer är svåra att få tag på.
Protocol
Representative Results
Discussion
De detaljerade metoderna som presenteras här har utvecklats för att studera perifer nervsystemets neoplasi och MPNST-patogenes. Även om vi har funnit att dessa metoder är effektiva, bör det erkännas att det finns vissa potentiella begränsningar för de metoder vi beskriver här. Nedan diskuterar vi några av dessa begränsningar och potentiella strategier för att övervinna dem i andra modellsystem.
Vi har funnit att helexomsekvensering effektivt identifierar mutationer av intresse i P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av anslag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 och R01 NS109655 till S.L.C.; R01 NS109655-03S1 till D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 till S.L.C.) och försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 och W81XWH-12-1-0164 till S.L.C.).
Materials
| Bioruptor Sonication System | Diagenode | UCD-600 | |
| CASAVA 1.8.2 | |||
| Cbot | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software | |||
| Citrisolve Hybrid | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Corning 96-well Black Microplate | Millipore Sigma | CLS3603 | |
| Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes | Diagenode | C30010009 | |
| dNTP mix | Clontech | 639210 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Elution buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’ | |||
| FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’ | |||
| GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ | HPLC purified | ||
| GraphPad Prism | Dotmatics | ||
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Illumina HiScanSQ | Illumina, San Diego, CA | N/A | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| PLUS Transfection Reagent | Thermo Scientific | 11514015 | |
| Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR1003G | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Qiagen Buffer P1 | Qiagen | 19051 | |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ | |||
| RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’ | |||
| Titanium Taq polymerase | Clontech | 639210 | |
| Trimmomatic software | www.usadellab.org |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
- Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
- Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
- Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
- Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
- Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
- Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
- Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
- Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
- Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
- Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
- Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
- Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
- Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
- Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
- Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
- Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
- Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
- Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
- Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
- Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).
