माउस कंकाल की मांसपेशी की असमान थोक संस्कृति आला और स्टेम सेल की गतिशीलता को पुन: उत्पन्न करने के लिए
Summary
कंकाल की मांसपेशी में निवासी स्टेम कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक मांसपेशी होमियोस्टैसिस और पुनर्जनन में विशेष योगदान देता है। यहां, मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं की 2 डी संस्कृति और एक पूर्व विवो सेटिंग में मांसपेशी कोशिका आला जो कई शारीरिक, विवो और पर्यावरणीय विशेषताओं को संरक्षित करती है, का वर्णन किया गया है।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी शरीर का सबसे बड़ा ऊतक है और हरकत से लेकर शरीर के तापमान नियंत्रण तक कई कार्य करता है। इसकी कार्यक्षमता और चोटों से वसूली सेल प्रकारों की भीड़ और कोर मांसपेशी कोशिकाओं (मायोफाइबर, मांसपेशी स्टेम सेल) और उनके आला के बीच आणविक संकेतों पर निर्भर करती है। अधिकांश प्रयोगात्मक सेटिंग्स इस जटिल शारीरिक माइक्रोएन्वायरमेंट को संरक्षित नहीं करती हैं, और न ही वे मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो अध्ययन की अनुमति देते हैं, एक सेल अवस्था जो उनके लिए महत्वपूर्ण है। यहां, उनके आला के सेलुलर घटकों के साथ मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की पूर्व विवो संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है। मांसपेशियों के यांत्रिक और एंजाइमेटिक टूटने के माध्यम से, सेल प्रकारों का मिश्रण प्राप्त किया जाता है, जिसे 2 डी संस्कृति में रखा जाता है। इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है कि 1 सप्ताह के भीतर, कई आला कोशिकाएं मायोफाइबर के साथ संस्कृति में मौजूद हैं और, महत्वपूर्ण रूप से, पैक्स 7-पॉजिटिव कोशिकाएं जो क्विसेंट मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं को प्रदर्शित करती हैं। ये अद्वितीय गुण इस प्रोटोकॉल को सेल प्रवर्धन और क्विसेंट जैसी स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं जिनका उपयोग मौलिक और ट्रांसलेशनल प्रश्नों को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
आंदोलन, श्वास, चयापचय, शरीर की मुद्रा, और शरीर का तापमान रखरखाव सभी कंकाल की मांसपेशियों पर निर्भर करते हैं, और कंकाल की मांसपेशियों में खराबी, इस प्रकार, दुर्बल विकृति (यानी, मायोपैथिस, मांसपेशियों की डिस्ट्रोफी, आदि) का कारण बन सकती है। 1. इसके आवश्यक कार्यों और बहुतायत को देखते हुए, कंकाल की मांसपेशियों ने दुनिया भर में अनुसंधान प्रयोगशालाओं का ध्यान आकर्षित किया है जो सामान्य मांसपेशी समारोह का समर्थन करने वाले प्रमुख पहलुओं को समझने का प्रयास करते हैं और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। इसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन और स्टेम सेल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल है, क्योंकि स्वस्थ मांसपेशी पूरी तरह से चोट और अध: पतन के बाद पूरी तरह से आत्म-मरम्मत कर सकती है, ज्यादातर इसके निवासी स्टेम सेल2 के कारण; इन्हें उपग्रह कोशिकाएं भी कहा जाता है और मांसपेशी फाइबर3 की परिधि में बेसल लैमिना के तहत स्थानीयकृत होते हैं।
वयस्क कंकाल की मांसपेशियों की मुख्य कोशिकाएं मायोफाइबर (लंबी सिंकेटियल मल्टीन्यूक्लियर कोशिकाएं) और उपग्रह कोशिकाएं (मायोजेनिक क्षमता वाली स्टेम कोशिकाएं हैं जो तब तक सक्रिय होती हैं जब तक कि चोट उन्हें सक्रिय नहीं करती है)। बाद की कोशिकाएं मांसपेशियों के पुनर्जनन की केंद्रीय कोशिकाएं हैं, और यह प्रक्रिया उनकी अनुपस्थिति में नहीं हो सकतीहै 4,5,6,7। उनके तत्काल माइक्रोएन्वायरमेंट में, कई सेल प्रकार और आणविक कारक हैं जो उन्हें संकेत देते हैं। यह आला धीरे-धीरे पूरे विकास में और वयस्कता8 तक स्थापित होता है। वयस्क मांसपेशियों में कई सेल प्रकार (एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट, मैक्रोफेज, फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज-एफएपी, नियामक टी कोशिकाएं, आदि) होते हैं। 9,10 और बाह्य मैट्रिक्स घटक (लैमिनिन, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, फाइब्रिलिन, पेरीओस्टिन, आदि) 11 जो स्वास्थ्य, बीमारी और पुनर्जनन के संदर्भ में एक दूसरे के साथ और उपग्रह कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं।
प्रयोगात्मक सेटिंग्स में इस जटिल आला को संरक्षित करना मौलिक लेकिन चुनौतीपूर्ण है। समान रूप से कठिन है क्वीसेंस को बनाए रखना या वापस लौटना, एक सेल अवस्था जोउपग्रह कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है। इन चुनौतियों से आंशिक रूप से निपटने के लिए कई तरीके पेश किए गए हैं, प्रत्येक के फायदे और नुकसान (चर्चा अनुभाग में विस्तृत)। यहां, एक विधि प्रस्तुत की गई है जो इन दो बाधाओं को आंशिक रूप से दूर कर सकती है। मांसपेशियों को शुरू में काटा जाता है और फिर हेटरोजेनस सेल मिश्रण को संस्कृति में डालने से पहले यांत्रिक और एंजाइमेटिक रूप से तोड़ दिया जाता है। संस्कृति के दौरान, आला के कई सेल प्रकारों का पता लगाया जाता है, और उपग्रह कोशिकाएं जो चमक में लौट आई हैं, देखी जाती हैं। प्रोटोकॉल के अंतिम चरण के रूप में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस चरण जो सार्वभौमिक रूप से स्वीकृत मार्करों के उपयोग के माध्यम से प्रत्येक सेल प्रकार का पता लगाने की अनुमति देते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क कंकाल की मांसपेशी समारोह को सेलुलर इंटरैक्शन और आणविक संकेतों के एक बारीक व्यवस्थित सेट द्वारा रेखांकित किया जाता है। यहां, एक विधि प्रस्तुत की जाती है जो एक पूर्व विवो सेटिंग में इन मापदंडो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चित्रा 2 के लिए, सर्वियर मेडिकल आर्ट (https://smart.servier.com/) के टेम्प्लेट का उपयोग किया गया था। एफआर प्रयोगशाला को एसोसिएशन फ्रैंकाइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस – एएफएम के माध्यम से ट्रांसलामसल (अनुदान 19507 और 22946), फोंडेशन पोर ला रेचरचे मेडिकेल – एफआरएम (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), एजेंस नेशनल े पोर ला रेचरचे – एएनआर (एएनआर -21-सीई 13-0006-02, एएनआर -19-सीई 13-0006-02, एएनआर -19-सीई 13-13-13-10) द्वारा समर्थित किया गया है। उपरोक्त फंडर्स की इस अध्ययन के डिजाइन, संग्रह, विश्लेषण, व्याख्या, या रिपोर्टिंग या इस पांडुलिपि के लेखन में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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