이 연구에서는 물 샘플의 세 가지 주요 clade에서 Leptospira 를 검출하도록 dot-blot 응용 프로그램을 설계했습니다. 이 방법을 사용하면 항-디곡시제닌 항체에 의해 쉽게 검출되는 디곡시제닌 표지 프로브에 의해 특이적으로 표적화된 최소 DNA 양을 식별할 수 있습니다. 이 접근 방식은 스크리닝 목적에 유용하고 만족스러운 도구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
도트 블롯은 운반체 DNA가 있는 상태에서 프로브 교잡에 의해 특이적으로 표적이 되는 최소한의 DNA를 식별할 수 있는 간단하고 빠르며 민감하고 다재다능한 기술입니다. 이는 알려진 양의 DNA를 나일론 멤브레인과 같은 불활성 고체 지지체에 전달하여 도트 블롯 장치를 사용하고 전기 영동 분리 없이 수행하는 것을 기반으로 합니다. 나일론 멤브레인은 높은 핵산 결합력(400 μg/cm2), 고강도의 장점이 있으며 양전하 또는 중성으로 대전됩니다. 사용된 프로브는 디곡시게닌(digoxigenin, DIG)으로 길게 표지된 18-20개의 염기로 구성된 매우 특이적인 ssDNA 단편입니다. 프로브는 렙토스피라 DNA와 결합합니다. 프로브가 표적 DNA와 하이브리드화되면 항-디고시제닌 항체에 의해 검출되어 X선 필름에 드러난 방출을 통해 쉽게 검출할 수 있습니다. 방출이 있는 점은 관심 DNA 조각에 해당합니다. 이 방법은 프로브의 비동위원소 라벨링을 사용하며, 이는 매우 긴 반감기를 가질 수 있습니다. 이 표준 면역 표지의 단점은 동위원소 프로브보다 민감도가 낮다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 도트 블롯 분석을 결합하여 완화됩니다. 이 접근 방식을 통해 표적 염기서열과 검출을 강화할 수 있습니다. 또한, 잘 알려진 표준물질의 연속 희석과 비교할 때 정량적 응용 분야로 사용될 수 있습니다. 물 샘플의 세 가지 주요 clades에서 Leptospira 를 검출하기 위한 dot-blot 응용 프로그램이 여기에 제시되어 있습니다. 이 방법론은 렙토스피나선형 DNA의 존재에 대한 증거를 제공하기 위해 원심분리에 의해 농축된 많은 양의 물에 적용할 수 있습니다. 이것은 일반적인 스크리닝 목적을 위한 가치 있고 만족스러운 도구이며, 물에 존재할 수 있는 다른 배양 불가능한 박테리아에 사용할 수 있어 생태계에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
서론
인간의 렙토스피라증은 주로 환경적 요인에 의해 발생한다 1,2. 호수, 강 및 하천에 렙토스피라가 존재한다는 것은 야생 동물과 결국 이러한 수역과 접촉할 수 있는 가축 및 생산 동물 사이에서 렙토스피라증이 전염된다는 지표입니다 1,3,4. 또한, 렙토스피라(Leptospira)는 하수, 정체 및 수돗물을 포함한 비자연적 자원에서 확인되었습니다 5,6.
렙토스피라는 전 세계에 분포하는 박테리아 7,8이며, 보존 및 전파에 있어 환경의 역할은 잘 알려져 있습니다. 렙토스피라(Leptospira)는 pH와미네랄이 다양한 음용수9와자연 ....
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프로토콜
1. 시료 전처리
- 4°C에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리하여 각 물 샘플을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 농축합니다. 이 단계를 필요한 만큼 반복하여 샘플을 250μL의 부피로 농축합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조).
- 사용할 dot-blot 프로브에 따라 특정 PCR을 수행합니다(표 1).
- 각 물 샘플 또는 참조 게놈-DNA에서 1 X 완충액, 2.5 단위의 Taq 중합효소, 1 μM의 각 프라이머, 0.2 mM의 각 dNTP, 1.5 mM MgCl2 및 100 ng의 표적 DNA를 포함하는 25 μL의 최종 부피로 PCR 튜브에서 증폭을 수행합니다.
- 열순환 조건에 따라 열순환기에서 PCR 반응을 프로그래밍합니다(표 2).
- 사용할 때까지 4 °C에서 반응을 보관하십시오.
- 블롯팅할 각 PCR 산물의 10μL를 96웰 플레이트의 별도 웰에 넣습니다.
- 각 웰에 40μL의 TE를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
알....
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결과
이 기술의 효과를 평가하기 위해 각 Leptospira 혈청형의 순수 배양에서 얻은 게놈 DNA와 clade 특이적 프로브를 함께 사용했습니다. 멤브레인은 각 혈청형에 대해 PCR 반응당 100ng의 게놈 DNA로 제조한 후, 비관련 박테리아의 8개 게놈 DNA와 임시 렙토스피라 혈청형의 다양한 농도의 게놈 DNA로 제조했습니다. 각 분석에는 양성, 음성 및 비템플릿 대조군이 포함되었습니다. 이러한 비관련 게놈 DNA는 점-블롯 프로브에 대한 친화성을 나타내지 않았습니다. 멤브레인 분포 및 도트 블롯 멤브레인은 보충 그림 2, 보충 그림 3, 보충 그림 4, 보충 그림 5, 보충 그림 6.......
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토론
도트 블롯 기법의 중요한 단계에는 (1) DNA 고정화, (2) 비상동 DNA로 멤브레인의 자유 결합 부위 차단, (3) 어닐링 조건에서 프로브와 타겟 단편 사이의 상보성, (4) 비혼성화 프로브 제거, (5) 리포터 분자41의 검출이 포함됩니다.
PCR-도트-블롯은 특정 제한사항을 갖는데, 이를테면 이 기술은 혼성화된 단편(37)의 크기에 관한 정보를 제공하지 않고, 제2 또는 제3 프로브와의 재혼성화 전에 단일 막의 탈혼성화를 요구하며, 최종 결과까지 상당한 시간과 노력을 필요로 한다.
이 기술은 다른 분자 기술42,43 및 그 응용과의 일관성을 보여주었습니다. 역점-블롯, 나노골드 점-블롯21 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 멕시코 국립 자치 대학교 (National Autonomous University of Mexico)의 수의학 및 동물 공학 학부 미생물학 및 면역학과의 렙토스피라 컬렉션에 빚을지고 있습니다. 우리는 참조 Leptospira 균주의 관대 한 기부에 감사드립니다. Leptospira fainei serovar Hurstbridge 균주 BUT6 및 Leptospira biflexa serovar Patoc 균주 Patoc I에서 Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. CIBAC 코디네이터인 Dr. José Antonio Ocampo Cervantes와 직원들의 물류 지원에 감사드립니다. EDT는 Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa의 학부생을 위한 터미널 프로젝트 프로그램에 있었습니다. 우리는 그림 1과 3에서 9까지의 생성을 위한 Biorender.com 소프트웨어를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Purelink DNA 추출 키트 | Invitrogen | K182002 | |
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq 중합효소 키트) | Promega | M3001 | |
| Whatman 여과지, 등급 1, | Merk | WHA1001325 | |
| 나일론 멤브레인, 양전하를 띤 롤 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody | Roche | 11093274910 | |
| Medium Base EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Enrichment EMJH | Difco | BD 279510 | |
| 차단 시약 | Roche | 11096176001 | |
| CSPD 즉시 사용 가능 디소듐 3-(4-메톡시스피로 {1,2-디옥세탄-3,2&프라임;-(5&프라임;-클로로) 트리사이클로[3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) 페닐 포스페이 | Merk | 11755633001 | |
| 청어 정자에서 추출한 디옥시리보 핵산 | Sigma Aldrich | D3159 | |
| 개발자 Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| 디곡시제닌-11-ddUTP | 로슈 | 11363905910 | |
| EDTA, 디소듐 염 (이수화물) | 프로메가 | H5032 | |
| 피콜 400 | 시그마 알드리치 | F8016 | |
| 정착액 케어 | 스트림 케어스트림 헬스 Inc | GBX 5158605 | |
| 라우릴 설페이트 나트륨 염 (소듐 도데실 설페이트; SDS) C12H2504SNa | 시그마 Aldrich | L5750 | |
| N-라우로일사르코신 나트륨 염 CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | 시그마 Aldrich | L-9150 | 음이온 성 계면 활성제입니다 |
| Polivinylpyrrolidone (PVP-40), | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| 폴리에틸렌 글리콜, 소르 비탄 모노 laurate (트윈 20), | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| 염화나트륨 (NaCl), | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) | , Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| 수산화 나트륨 (NaOH) | 시그마 알드리치 | 1310-73-2 | |
| 인산 나트륨 이염기성 (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| 말단 전이 효소, 재조합 | Roche | 3289869103 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | 다음과 같이 집에서 만들 수 있습니다. 보충 파일 6 |
| 프라이머 | Sigma-Aldrich | 수요에 따라 | 표 1 |
| 프로브를 따르세요. | Sigma-Aldrich | 수요에 따라 | 표 1 |
| 을 따르세요Equipment | |||
| Nanodrop™ 분광 광도계 | 1 개 Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| 냉장 마이크로 원심 분리기 Sigma 1-14K, 14,000 rpm | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| 소독 조절 가능한 피펫, 범위 2-20 µ에서 1.5ml 마이크로 원심 분리기 튜브의 원심 분리에 적합; l, 20-200 &마이크로; l | Gilson | SKU : F167360 | |
| 일회용 1.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브 (오토 클레이브) | Axygen | MCT-150-SP | |
| 일회용 600 µ l 마이크로 원심 분리기 튜브 (오토 클레이브) | Axygen | 3208 | |
| 일회용 피펫 팁 1-10 µ l | Axygen | T-300 | |
| 일회용 피펫 팁 1-200 &마이크로; l | Axygen | TR-222-Y | |
| 도트 블롯 장치 Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| 휴대용 Hergom 흡입 | Hergom | 7E-A | |
| 과학적인 라이트 박스 (가시광선 PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV Crosslinker | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | ||
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참고문헌
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
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재인쇄 및 허가
