Polymeraskedjereaktion och dot-blot-hybridisering för Leptospira-detektion i vattenprover

Summary

I denna studie utformades en dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover. Denna metod gör det möjligt att identifiera minimala DNA-mängder som specifikt angrips av en digoxigeninmärkt sond, som lätt detekteras av en anti-digoxigenin-antikropp. Detta tillvägagångssätt är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för screeningändamål.

Abstract

Dot-blot är en enkel, snabb, känslig och mångsidig teknik som gör det möjligt att identifiera minimala mängder DNA som specifikt är måltavla för sondhybridisering i närvaro av bärar-DNA. Den är baserad på överföring av en känd mängd DNA till ett inert fast stöd, såsom ett nylonmembran, med hjälp av dot-blot-apparaten och utan elektroforetisk separation. Nylonmembran har fördelen av hög nukleinsyrabindningskapacitet (400 μg/cm²), hög hållfasthet och är positivt eller neutralt laddade. Sonden som används är ett mycket specifikt ssDNA-fragment av 18 till 20 baser som är märkta med digoxigenin (DIG). Sonden kommer att konjugera med Leptospiras DNA. När sonden har hybridiserats med mål-DNA:t detekteras den av en anti-digoxigeninantikropp, vilket gör det lätt att upptäcka den genom dess utsläpp som avslöjas i en röntgenfilm. Prickarna med en emission kommer att motsvara de DNA-fragment som är av intresse. Denna metod använder icke-isotopisk märkning av sonden, som kan ha en mycket lång halveringstid. Nackdelen med denna standardimmunetikett är en lägre känslighet än isotopsonder. Icke desto mindre mildras det genom att koppla polymeraskedjereaktion (PCR) och dot-blot-analyser. Den här metoden gör det möjligt att berika målsekvensen och identifiera den. Dessutom kan det användas som en kvantitativ applikation jämfört med en seriell utspädning av en välkänd standard. En dot-blot-applikation för att detektera Leptospira från de tre huvudkladerna i vattenprover presenteras här. Denna metod kan tillämpas på stora mängder vatten när de har koncentrerats genom centrifugering för att ge bevis på närvaron av Leptospiral-DNA. Detta är ett värdefullt och tillfredsställande verktyg för allmänna screeningändamål och kan användas för andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten, vilket förbättrar förståelsen av ekosystemet.

Introduction

Leptospiros hos människor har huvudsakligen sitt ursprung i miljökällor ^1,2. Förekomsten av Leptospira i sjöar, floder och vattendrag är en indikator på överföring av leptospiros bland vilda djur och tamdjur och produktionsdjur som så småningom kan komma i kontakt med dessa vattenförekomster ^1,3,4. Dessutom har Leptospira identifierats i icke-naturliga källor, inklusive avloppsvatten, stillastående vatten och kranvatten ^5,6.

Leptospira är en bakterie som distribueras över hela världen ^7,8, och miljöns roll i dess bevarande och överföring har varit välkänd. Leptospira kan överleva i dricksvatten under varierande pH och mineraler⁹, och i naturliga vattenförekomster¹. Den kan också överleva under långa perioder i destillerat vatten¹⁰, och under konstant pH (7,8) kan den överleva upp till 152 dagar¹¹. Dessutom kan Leptospira interagera i bakteriella konsortier för att överleva svåra förhållanden^12,13. Det kan ingå i biofilm i sötvatten med Azospirillum och Sphingomonas och kan till och med växa och uthärda temperaturer över 49 °C^14,15. Den kan också föröka sig i vattenmättad jord och förbli livskraftig i upp till 379 dagar¹⁶, vilket bevarar dess förmåga att orsaka sjukdomen så länge som ett år^17,18. Man vet dock inte mycket om ekologin i vattendrag och hur den är fördelad inom dem.

Sedan upptäckten har studiet av släktet Leptospira baserats på serologiska tester. Det var inte förrän under det innevarande århundradet som molekylära tekniker blev mer utbredda i studiet av denna spiroket. Dot-bloten har knappast använts för att identifiera den med hjälp av (1) en isotopsond baserad på 16S rRNA och på en inter-simple sequence repeat (ISSR)^19,20, (2) som en nanoguldbaserad immunanalys för human leptospiros applicerad på urin²¹, eller (3) som en antikroppsbaserad analys för urinprover från nötkreatur²². Tekniken föll ur bruk eftersom den ursprungligen var baserad på isotopsonder. Det är dock en välkänd teknik som, tillsammans med PCR, ger förbättrade resultat, och den anses vara säker på grund av användningen av icke-isotopiska sonder. PCR spelar en avgörande roll i anrikningen av Leptospira DNA genom att amplifiera ett specifikt DNA-fragment som kan hittas i spårmängder i ett prov. Under varje PCR-cykel fördubblas mängden av det riktade DNA-fragmentet i reaktionen. I slutet av reaktionen har amplikonet multiplicerats med en faktor på mer än en miljon²³. Produkten amplifierad med PCR, som ofta inte syns i agaroselektrofores, blir synlig genom specifik hybridisering med en DIG-märkt sond i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-tekniken är enkel, robust och lämplig för många prover, vilket gör den tillgänglig för laboratorier med begränsade resurser. Det har använts i en mängd olika bakteriestudier, inklusive (1) orala bakterier²⁷, (2) andra provtyper som mat och avföring²⁸, och (3) identifiering av icke-odlingsbara bakterier²⁹, ofta i överensstämmelse med andra molekylära tekniker. Bland fördelarna med dot-blot-tekniken är: (1) Membranet har en hög bindningskapacitet, som kan binda över 200 μg/cm² nukleinsyror och upp till 400 μg/cm²; (2) Dot-blot-resultat kan tolkas visuellt utan att det krävs specialutrustning, och (3) de kan bekvämt förvaras i åratal i rumstemperatur (RT).

Släktet Leptospira har klassificerats i patogena, intermediära och saprofytiska klader^30,31. Skillnaden mellan dessa klader kan uppnås baserat på specifika gener som lipL41, lipL32 och 16S rRNA. LipL32 finns i de patogena kladerna och uppvisar hög känslighet i olika serologiska och molekylära verktyg, medan det saknas hos saprofytarter²¹. Hushållningsgenen lipL41 är känd för sitt stabila uttryck och används i molekylära tekniker³², medan 16S rRNA-genen används för deras klassificering.

Denna metod kan tillämpas på stora volymer vatten när de har koncentrerats genom centrifugering. Det gör det möjligt att bedöma olika punkter och djup i en vattenförekomst för att upptäcka förekomsten av leptospiral-DNA och den klad som den tillhör. Detta verktyg är värdefullt för både ekologiska och allmänna screeningändamål och kan också användas för att upptäcka andra icke-odlingsbara bakterier som kan finnas i vatten.

Dessutom är PCR- och dot-blot-analyser tekniskt och ekonomiskt överkomliga för ett brett spektrum av laboratorier, även de som saknar sofistikerad eller dyr utrustning. Denna studie syftar till att tillämpa den digoxigeninbaserade dot-bloten för att identifiera de tre Leptospira-kladerna i vattenprover insamlade från naturliga vattenförekomster.

Bakteriella stammar
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassoven och Wolffi) inkluderades i denna studie. Dessa serovarer är en del av samlingen vid institutionen för mikrobiologi och immunologi, fakulteten för veterinärmedicin och zooteknik, National Autonomous University of Mexico, och de används för närvarande i mikroagglutinationstestet (MAT).

Alla Leptospira serovarer odlades i EMJH och deras DNA extraherades med hjälp av ett kommersiellt DNA-extraktionskit (se Materialtabell). En genomisk DNA-blandning av de tolv serovarerna användes som en positiv kontroll för den patogena kladen Leptospira . Som en positiv kontroll av Leptospira intermediär klad inkluderades genomiskt DNA från Leptospira fainei serovar Hurstbridge stam BUT6, och som en positiv kontroll för Leptospira saprofytkladen inkluderades även genomiskt DNA från Leptospira biflexa serovar Patoc stam Patoc I.

Negativa kontroller bestod av en tom plasmid, DNA från icke-besläktade bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii och Escherichia coli) och PCR-klassat vatten, som fungerade som icke-mallkontroll.

Vattenprover
Tolv provprover samlades in med hjälp av en stratifierad-slumpmässig provtagningsmetod från Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16′ 54″ N 99° 6′ 11″ W). Dessa prover togs på tre djup: ytliga, 10 och 30 cm (Figur 1A, B). Rutinerna för att samla in vatten påverkade inte några utrotningshotade eller skyddade arter. Varje prov samlades in i ett sterilt 15 ml mikrocentrifugrör. För att samla in provet sänktes varje rör försiktigt ner i vattnet, fylldes på det valda djupet och förseglades sedan. Proverna hölls vid 22 °C och transporterades omedelbart till laboratoriet för bearbetning.

Varje prov koncentrerades genom centrifugering i sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 8000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur. Detta steg upprepades tills alla prover koncentrerades till ett rör, som sedan användes för DNA-extraktion (Figur 1C).

Figur 1: Koncentration av vattenprover genom centrifugering. A) Vattenprovtagningsdammar och B) Naturliga vattendrag. C) Centrifugeringsbaserad bearbetning av vattenprover i upprepade steg så många gånger som behövs (n). Klicka här för att se en större version av denna figur.

DNA-extraktion
Totalt DNA isolerades med hjälp av ett kommersiellt genomiskt DNA-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). DNA-extraktioner eluerades i 20 μL elueringsbuffert och DNA-koncentrationen bestämdes av en UV-spektrofotometer vid 260-280 nm och förvarades vid 4 °C tills användning.

PCR-amplifiering
PCR-målen var de 16S rRNA-, lipL41- och lipL32-generna, som identifierar DNA från släktet Leptospira och gör det möjligt att skilja mellan de tre kladerna: patogen, saprofytisk och intermediär. Både primers och sonddesign baserades på tidigare arbeten av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. och Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen för varje sond, primer och amplifierat fragment beskrivs i tabell 1, och deras anpassning till referenssekvenser finns i Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4 och Supplementary File 5. PCR-reagenserna och termocykliska förhållanden beskrivs i protokollavsnittet.

Amplifieringsprodukter visualiserades genom elektroforetisk separation på en 1 % agarosgel i TAE (40 mM Tris-bas, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA; pH 8,3), vid 60 V i 45 minuter med etidium-bromiddetektion, som visas i kompletterande figur 1. Genomiskt DNA erhållet från varje serovar användes med koncentrationer från 6 x 10⁶ till 1 x 10⁴ genomekvivalenta kopior (GEq) i varje PCR-reaktion, baserat på genomstorleken för L. interrogans (4, 691, 184 bp)³⁸ för patogen Leptospira, genomstorleken för L. biflexa (3, 956, 088 bp)³⁹ för saprofytisk Leptospira, och genomstorleken för L. fainei serovar Hurstbridge stam BUT6 (4, 267, 324 bp) med accessionsnummer AKWZ00000000.2.

Sondernas känslighet bedömdes med DNA från varje patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc strain Patoc I och L. fainei serovar Hurstbridge strain BUT6 i varje experiment. För att bedöma specificiteten hos PCR- och dot-blot-hybridiseringsanalysen inkluderades DNA från icke-besläktade bakterier.

Tabell 1: PCR-primrar och sonder för att amplifiera produkter för identifiering av patogena, saprofyt- och intermediära klader av Leptospira. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Analys av dot-blot-hybridisering
Tekniken kallas dot-blot eftersom hålen som DNA-provet placeras i har en prickform, och när de sugs in för att fixeras på plats genom vakuumsugning får de denna form. Denna teknik utvecklades av Kafatos et ^al.40. Tekniken gör det möjligt att göra en semikvantifiering av Leptospira i varje PCR-positivt prov. Protokollet består av en denaturering med NaOH 0,4 M vid rumstemperatur, prover med Leptospira DNA från 30 ng till 0,05 ng, motsvarande 6 x 10⁶ till 1 x 10⁴ leptospirer, torkas på ett nylonmembran med en 96-brunnars dot-blot-apparat. Efter immobilisering binds DNA:t till membranet genom exponering för 120 mJ UV-ljus. Varje DNA-sond konjugeras med digoxigenin-11 dUTP genom ett terminalt överföringskatalyssteg i 3′-änden (Digoxigenin är en växtsteroid erhållen från Digitalis purpurea, som används som en reporter⁴¹). Efter den stränga hybridiseringen av den märkta DNA-sonden (50 pmol) vid den specifika temperaturen på mål-DNA, visualiseras DNA-hybriderna genom kemiluminiscensreaktionen med den anti-digoxigenin alkaliska fosfatasantikroppen kovalent konjugerad med dess substrat CSPD. Luminiscensen fångas genom exponering för en röntgenfilm (figur 2).

Figur 2: Steg i proceduren för PCR-dot-blot-analysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

1. Beredning av prover Koncentra varje vattenprov i 1,5 ml mikrocentrifugrör genom centrifugering vid 8 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa detta steg, så många gånger som krävs, för att koncentrera provet till en volym på 250 μL. Använd DNA-extraktionssatsen enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Utför den specifika PCR enligt den dot-blot-sond som ska användas (tabell 1).Utför amplif…

Representative Results

För att bedöma teknikens effektivitet användes genomiskt DNA från rena kulturer av varje Leptospira serovar, tillsammans med den kladspecifika sonden. Membran preparerades med 100 ng genomiskt DNA per PCR-reaktion för varje serovar, följt av åtta genomiskt DNA från icke-besläktade bakterier och variabla koncentrationer av genomiskt DNA från ad hoc Leptospira-serovarerna. Varje analys inkluderade positiv, negativ och icke-mallkontroll. Detta icke-besläktade genomiska DNA visade ingen affinitet…

Discussion

De kritiska stegen i dot-blot-tekniken inkluderar (1) DNA-immobilisering, (2) blockering av de fria bindningsställena på membranet med icke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellan sonden och målfragmentet under glödgningsförhållanden, (4) avlägsnande av den ohybridiserade sonden och (5) detektion av reportermolekylen⁴¹.

PCR-Dot-bloten har vissa begränsningar, till exempel att tekniken inte ger information om storleken på det hybridiserade fragmentet<sup cla…

Materials

REAGENTS
Purelink DNA extraction kit	Invitrogen	K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)	Promega	M3001
Whatman filter paper, grade 1,	Merk	WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m	Roche	11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody	Roche	11093274910
Medium Base EMJH	Difco	S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH	Difco	BD 279510
Blocking Reagent	Roche	11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate	Merk	11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma Aldrich	D3159
Developer Carestream	Carestream Health Inc	GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP	Roche	11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)	Promega	H5032
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F8016
Fixer Carestream	Carestream Health Inc	GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa	Sigma Aldrich	L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa	Sigma Aldrich	L-9150	It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)	Sigma Aldrich	PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)	Sigma Aldrich	9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	7558-79-4
Terminal transferase, recombinant	Roche	3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)	Sigma-Aldrich	1185-53-1
SSPE 20X	Sigma-Aldrich	S2015-1L	It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Probes	Sigma-Aldrich	On demand	Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer	Thermo-Scientific	ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm	Sigma-Aldrich	1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl	Gilson	SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)	Axygen	3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl	Axygen	T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl	Axygen	TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot	BIORAD	1706545
Portable Hergom Suction	Hergom	7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)	Hoefer	PH90-115V
UV Crosslinker	Hoefer	UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler	Hybaid	HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17	Fuji