Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.
Fotoreseptör hücrelerin ve retina pigment epitelyal (RPE) hücrelerinin transplantasyonu, retina dejenerasyonu hastalıkları için potansiyel bir tedavi sağlar. Terapötik donör hücrelerin fare alıcılarına subretinal transplantasyonu, fare gözünün küçük hacminin izin verdiği sınırlı cerrahi alan nedeniyle zordur. Fare alıcılarında ekzojen hücrelerin subretinal iletimini kolaylaştırmak için doğrudan transpupiller görme kılavuzluğuna sahip bir transskleral cerrahi transplantasyon platformu geliştirdik. Platform, çubuk açısından zengin Rho::EGFP farelerinden ve koni açısından zengin OPN1LW-EGFP’den toplanan retina hücre süspansiyonları ve üç boyutlu retina tabakaları kullanılarak test edildi ; NRL-/- fareler, sırasıyla. Canlı/ölü testi, her iki donör hücre formu için düşük hücre mortalitesi gösterdi. Retina greftleri, multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskop (cSLO) görüntüleme ile tespit edilen minimum cerrahi komplikasyonla, bir fare retina dejenerasyonu modeli olan Rd1/NS’nin subretinal boşluğuna başarıyla verildi. Transplantasyondan iki ay sonra, histolojik boyama, retinal greftlerin subretinal boşlukta ‘yetişkin’ çubuklara ve konilere (sırasıyla sağlam Rho::EGFP, S-opsin ve OPN1LW:EGFP ekspresyonu ile) ileri olgunlaştığına dair kanıtlar gösterdi. Burada, fare alıcılarında düşük komplikasyon oranıyla son derece hassas subretinal doğumu mümkün kılabilen cerrahi bir platform sunuyoruz. Bu teknik, beceri edinmede hassasiyet ve göreceli kolaylık sunar. Ayrıca, teknik sadece subretinal hücre nakli çalışmaları için değil, aynı zamanda gen terapileri de dahil olmak üzere diğer göz içi terapötik çalışmalar için de kullanılabilir.
Fotoreseptör ve retina pigmentli epitelyal (RPE) hücrelerin transplantasyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retinal dejeneratif hastalıklar için potansiyel tedavi sağlar1,2,3,4,5,6,7. Dejenere retinadaki hastalıklı fotoreseptörleri ve RPE hücrelerini yenilemek veya değiştirmek için, konakçı fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin laminer anatomisi göz önüne alındığında, subretinal boşluk özellikle bir transplantasyon hedefi olarak çok uygundur. RPE hücrelerinin retina altı transplantasyonunun cerrahi prosedürleri büyük hayvanlarda 8,9,10 ve klinik çalışmalarda11,12,13 iyi kurulmuş olsa da, fotoreseptör transplantasyonu araştırmalarının karşılaştığı zorluklar arasında transgenik büyük hayvan modellerinin azlığı ve diğer endişelerin yanı sıra nöronal transplantasyonda yer alan derinlemesine sinaptogenez mekanizmalarının sınırlı anlaşılması yer almaktadır. Çeşitli retinal dejenerasyon mutantlarına sahip genetiği değiştirilmiş fare modelleri, transplantasyon bağlamında moleküler mekanizmaları incelemek ve klinik öncesi aşamadaetkili hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini yönlendirmek için yararlı araçlar sağlar 14,15,16,17,18.
Büyük hayvanlarda (örneğin, domuz, maymun) nispeten büyük göz ve küçük kristal merceğin aksine, fare gözlerinin küçük boyutlu ve büyük kristal merceği, özellikle fiziksel alan kısıtlamalarının ve sınırlı doğrudan görselleştirmenin temel zorluklar olduğu subretinal transplantasyon için onları zor cerrahi hedefler haline getirir.
Mevcut yaklaşımlar, enjeksiyon yoluna göre üç ana tipte sınıflandırılabilir. İlk olarak, trans-korneal yaklaşım durumunda, iğne korneadan vitreus boşluğuna ve daha sonra subretinal boşluğageçirilir 19,20. Bu yöntem kullanılarak başarılı subretinal doğum sağlanabilir, ancak ön segment yapılarındaki (yani kornea, iris, lens) hasar, aşağı akışı ciddi şekilde engelleyebilecek büyük bir risktir in vivo analiz. İkincisi, trans-vitreus yaklaşımı durumunda, iğne vitreus boşluğuna pars plana ve daha sonra subretinal boşluğagirer 21. Bu yaklaşım insanlarda ve büyük hayvanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lens vitreus boşluğunun daha büyük bir nispi hacmini kapladığı için kemirgenlerde potansiyel lens hasarı riski vardır. Özellikle, hem trans-korneal hem de trans-vitreus protokolleri, subretinal boşluğa ulaşmak için nöral retinanın penetrasyonunu gerektirir, bu da konakçı retinaya zarar verir ve penetrasyon deliğinden donör hücre reflü riskini artırır. Üçüncüsü, trans-skleral yaklaşım22,23 durumunda, iğne skleral-koroid-RPE kompleksinden geçer ve doğrudan subretinal boşluğa girer. Bu yaklaşım, ön segment yapılarının ve vitreus boşluğunun potansiyel travmasını azaltır. Bununla birlikte, konakçı fundusun doğrudan görüntülenmesi olmadan, trans-retinal ponksiyonlar, RPE dekolmanı ve koroid kanamasının neden olduğu cerrahi başarısızlıklar yaygın olarak tespit edilir.
Burada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir trans-skleral cerrahi platform geliştirdik. Transplantasyondan önce donör retina tabakalarının ve hücre süspansiyonlarının canlılığının doğrulanması yapıldı. Donör hücrelerin bir retina dejenerasyonu fare modelinin subretinal boşluğuna başarılı bir şekilde verildiği doğrulandı. Sadece nadir görülen cerrahi komplikasyonlar tespit edildi. Ek olarak, retina greftlerinde nakledilen fotoreseptörler hayatta kaldı ve transplantasyondan iki ay sonra “yetişkin” çubuklara ve konilere ileri olgunlaşma kanıtı gösterdi.
Farelerde subretinal transplantasyon, fare gözlerinin küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur. Bu çalışmada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir platform geliştirdik. Platform, donör canlılığı korumasında tutarlılık, başarılı subretinal doğum sağlar ve düşük komplikasyon oranı sağlar.
Burada tasvir edilen subretinal transplantasyon tekniği, enjeksiyon iğnesinin göz duvarının dış katmanlarına (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz ettiği trans-skleral yola dayalı olarak geliştirilmiştir. Trans-korneal19,20 ve trans-vitreus21,26,27 yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, trans-skleral yaklaşım, ön segment yapılarına ve nöral retinaya nüfuz etmeden doğrudan subretinal boşluğa girer, böylece zararsız bir nakil sağlar ve delici delikten donör hücre reflüsü riskini azaltır. Transskleral yaklaşımın bir zorluğu, iğne ucunun terminal doğum bölgesine gelmeden önce subretinal boşluk boyunca yayılmasını sağlarken, bitişik RPE ve koroid katmanlarının potansiyel rahatsızlığını önlemektir. Doğrudan görsel rehberlik olmadan geleneksel bir transskleral yaklaşımla28,29 bu hedeflere ulaşmak zordur. Bu çalışmada, fare modellerinde subretinal transplantasyonu kolaylaştırmak için cerrahi mikroskop ve retinanın dış aydınlatmasını kullanarak transpupiller görme kılavuzluğunda bir platform geliştirdik. Platform, alıcı fundusun cerrahi mikroskop altında gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayarak operatörün cerrahi süreci ve alıcıların retina durumunu izlemesine olanak tanır. Örneğin, sklera-koroid-RPE kompleksinin başarılı bir şekilde penetrasyonu, transpupiller görselleştirme yoluyla iğne ucunun nispeten parlak bir yansıması ile basitçe doğrulanabilir. Daha da önemlisi, transpupiller görselleştirme ile yönlendirildiğinde, operatör, iğne ile alıcı retinadaki anatomik yapılar (örneğin, retina damarları ve optik sinir başı) arasındaki göreceli konuma göre enjeksiyon açısını ve derinliğini doğru bir şekilde modüle edebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak materyallerin doğru bir şekilde uygulanması, RPE, koroid travması ve diğer cerrahi komplikasyonları en aza indirebilir. Gerçekten de, transpupiller görselleştirme yardımıyla retina kan damarlarına yakın manevralardan kaçınarak kanamaların en aza indirilebileceğini bulduk.
Donör hücrelerin reflüsü, enjeksiyon sonrası cerrahi başarısızlığın önemli bir nedenidir29,30. Donör hücre reflüsünü teşvik etmede rol oynayan birçok faktör vardır. Enjekte edilen donör hücre karışımlarının neden olduğu alıcı gözlerin yüksek göz içi basıncı (GİB), hücrelerin göz dışına geri akışını destekleyen önemli bir faktördür. Protokolümüz, ameliyatın başlangıcında ön kamara penetrasyonu ile alıcıların GİB’sini azaltır ve vitreus iğnesini vitreus boşluğundan çekmeden önce GİB’nin sulu sıvı çıkışı ile kendiliğinden düşmesini sağlar. İkinci bir faktör, alıcıların gözlerindeki kapatılmamış enjeksiyon tünelidir. Greft reflüsünün enjeksiyon tünelinden geri dönmesini önlemek için, göz duvarına nüfuz ederken kendinden sızdırmaz bir tünel oluşturmak için küçük boyutlu bir mikro enjeksiyon iğnesi (34G) ve iğneyi çekerken dış tünel açıklığının kenarlarını tutmak için dişli mikro forseps kullanıyoruz. Konvansiyonel transplantasyonda, reflü greftler hızlı bir şekilde oluşabildikleri veya hızla dağılabildikleri için zor tespit edilirler. Sodyum hyaluronat, lamel uygulandığında, sklerotomi bölgesi de dahil olmak üzere limbus ve skleranın çoğunu kaplamak için neredeyse her zaman korneadan kayar. Hücre enjeksiyonunu takiben, sklerotomi bölgesindeki sodyum hiyalüronat, varsa geri akışlı içeriklerin toplu akışını yavaşlatmaya ve cerrahi mikroskop altında görsel olarak tespit edilebilir hale getirmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, reflü yokluğu, optik koherens tomografinin (OCT) mevcut olmadığı laboratuvarlar için yararlı olabilecek protokolümüzü kullanarak hücre süspansiyonları için subretinal blebin sabitliğini ve retina tabakasının göz içi konumunu izleyerek de doğrulanabilir.
Nakledilen retina tabakalarında önemli sayıda fotoreseptör hücresi hayatta kalırken, fark edilebilir bir hücresel oryantasyon veya tabaka oryantasyonu tespit edilemedi. 3D retina tabakalarının büyük hayvanlara verilmesi 26,31,32 olarak tespit edilmiş olmasına rağmen, farelerde subretinal boşluk, intraoperatif retinal görüntüleme yeteneğinin eksikliği ile birleştiğinde, intraoperatif olarak ve hemen postoperatif dönemde tabaka oryantasyonunun korunmasını sağlamayı çok zorlaştırır.
Fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir transskleral cerrahi platform tanımladık. Bu platform, yüksek enjeksiyon doğruluğu ve düşük cerrahi komplikasyon oranı sağlar. Bu platform, bilinen hücre dozlarının kesin olarak verilmesini sağlar, öğrenmesi nispeten kolaydır ve gen terapisi de dahil olmak üzere farklı terapötik ajan türleri için intra-retinal veya intravitreal enjeksiyonlara ek olarak subretinal iletimi kolaylaştırır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma aşağıdaki fonlarla finanse edilmiştir: NEI R01EY033103 (MSS), Körlükle Mücadele Vakfı (MSS), Shulsky Vakfı (MSS), Joseph Albert Hekimian Fonu (MSS), Juliette RP Vizyon Vakfı (YVL), Körlüğü Önleme Araştırmaları (Johns Hopkins Üniversitesi’ndeki Wilmer Göz Enstitüsü’ne ve Baylor Tıp Fakültesi’ndeki Cullen Göz Enstitüsü’ne sınırsız hibe). Dr. Malia Edwards’a (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi) mikroskop konusunda eğitim verdiği için teşekkür ederiz.
Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical materials/reagents | |||
Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
Xylazine | AnaSed Injection | N/A |