Saccharomyces cerevisiae में सिंगल-कॉपी जीन लोकस क्रोमैटिन शुद्धि
Summary
यह प्रोटोकॉल साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन के आधार पर एक स्थान-विशिष्ट क्रोमैटिन अलगाव विधि प्रस्तुत करता है ताकि नवोदित खमीर, सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया से अपने मूल क्रोमैटिन संदर्भ में ब्याज की एकल-प्रतिलिपि जीन लोकस को शुद्ध किया जा सके।
Abstract
यूकेरियोटिक क्रोमैटिन की मूल संगठनात्मक इकाई न्यूक्लियोसोम कोर कण (एनसीपी) है, जिसमें हिस्टोन ऑक्टेमर के चारों ओर ~ 1.7 बार लिपटे डीएनए शामिल हैं। क्रोमैटिन को एनसीपी और कई अन्य प्रोटीन परिसरों की इकाई के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसमें प्रतिलेखन कारक, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और एंजाइम को संशोधित करना शामिल है। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के दौरान विशिष्ट जीनोमिक लोकी के स्तर पर इन प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को कैसे ऑर्केस्ट्रेटेड किया जाता है। यह मुख्य रूप से वर्तमान तकनीकी सीमाओं के कारण है, जो इस तरह के गतिशील इंटरैक्शन के सटीक माप प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। यहां, हम अपने मूल क्रोमैटिन राज्य में ब्याज की एकल-प्रतिलिपि जीन स्थान को अलग करने के लिए एक कुशल एकल-चरण आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन के संयोजन की एक बेहतर विधि का वर्णन करते हैं। विधि जीनोमिक क्रोमैटिन पर लक्ष्य स्थान के मजबूत संवर्धन के लिए अनुमति देती है, जिससे यह तकनीक निष्पक्ष और व्यवस्थित तरीके से प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी रणनीति बनाती है, उदाहरण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा। इस तरह के रचनात्मक विश्लेषणों के अलावा, इस विधि द्वारा शुद्ध देशी क्रोमैटिन संभवतः न्यूक्लियोसोम पोजिशनिंग और हिस्टोन संशोधनों के बारे में विवो स्थिति को दर्शाता है और इसलिए, खमीर में लगभग किसी भी जीनोमिक लोकस से प्राप्त क्रोमैटिन के आगे संरचनात्मक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है।
Introduction
क्रोमैटिन में यूकेरियोटिक जीनोम का गतिशील संगठन डीएनए को नाभिक की सीमाओं के भीतर फिट करने के लिए कॉम्पैक्ट करता है, जबकि जीन अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त गतिशीलता और नियामक कारकों के लिए पहुंच सुनिश्चित करता है। भाग में, इस बहुमुखी प्रतिभा की मध्यस्थता न्यूक्लियोसोम द्वारा की जाती है, क्रोमैटिन की मूल इकाई, जिसमें हिस्टोन ऑक्टेमर1 के चारों ओर ~ 1.7 बार लिपटे डीएनए के 147 बीपी के साथ एक कोर कण होता है। न्यूक्लियोसोम इसकी संरचना के संबंध में एक अत्यधिक गतिशील संरचना है, जिसमें एन- और सी-टर्मिनल हिस्टोन पूंछ पर कई हिस्टोन वेरिएंट और पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) हैं। इसके अलावा, यूकेरियोटिक क्रोमैटिन अन्य आवश्यक घटकों की एक भीड़ के साथ बातचीत करता है, जैसे कि प्रतिलेखन कारक, डीएनए और आरएनए प्रसंस्करण मशीनरी, वास्तुशिल्प प्रोटीन, क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और संशोधन में शामिल एंजाइम, और क्रोमैटिन से जुड़े आरएनए अणु। प्रतिलेखन, प्रतिकृति और मरम्मत में शामिल इन महत्वपूर्ण मशीनरी को क्रोमैटिन तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जो इन प्रक्रियाओं के लिए प्राकृतिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है। नतीजतन, इन डीएनए लेनदेन में अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में क्रोमैटिन संरचना में सामूहिक परिवर्तनों की एक सटीक परिभाषा की आवश्यकता होती है जहां ये मशीनरी अभिसरण करती हैं और जैविक प्रतिक्रियाओं को सुविधाजनक बनाती हैं।
आनुवंशिकी और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययनों के माध्यम से कई क्रोमैटिन कारकों की पहचान के बावजूद, विशेष जीनोमिक साइटों पर क्रोमैटिन इंटरैक्शन के प्रत्यक्ष, निष्पक्ष और व्यापक विश्लेषण करना एक महत्वपूर्ण बाधा 2,3 बना हुआ है। प्रारंभ में, जीनोम (यानी, दोहराव लोकी) या बहु प्रतिलिपि प्लास्मिड के केवल अत्यधिक प्रचुर मात्रा में क्षेत्रों संबद्ध प्रोटीन 4,5,6,7 के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता में अलग किया जा सकता है. क्रोमैटिनाइज्ड डीएनए पर कब्जा जांच के प्रत्यक्ष संकरण के आधार पर नए दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला, CRISPR-dCas9 प्रणाली का उपयोग करके निकटता बायोटिनाइलेशन, या ब्याज के स्थान के लिए अनुक्रम-विशिष्ट एडाप्टर प्रोटीन के बंधन ने खमीर और स्तनधारी जीनोम 8,9,10 से एकल-कॉपी लोकी के प्रोटिओम को उजागर करना शुरू कर दिया है. हालांकि, इन सभी विधियों को प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को स्थिर करने के लिए फॉर्मलाडेहाइड क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता होती है और बाद में शुद्धि के लिए क्रोमैटिन को घुलनशील करने के लिए सोनिकेशन की आवश्यकता होती है। साथ में, दोनों जोड़तोड़ शुद्ध क्रोमैटिन के बाद के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन की संभावना को बाहर करते हैं।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम पहले खमीर11,12 से लक्षित गुणसूत्र डोमेन निकालने के लिए साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन को रोजगार है कि एक पद्धति तैयार की. संक्षेप में, ब्याज का जीनोमिक क्षेत्र ज़ीगोसैक्रोमाइसेस रूक्सी से साइट-विशिष्ट आर-रीकॉम्बिनेज के लिए मान्यता साइटों (आरएस) से घिरा हुआ है, साथ ही साथ एक ही क्षेत्र के भीतर प्रोकैरियोटिक ट्रांसक्रिप्शनल रिप्रेसर लेक्सा प्रोटीन (लेक्सा) के लिए तीन डीएनए बाध्यकारी साइटों के एक समूह को शामिल करता है। खमीर कोशिकाओं में आर-रीकॉम्बिनेज की एक साथ अभिव्यक्ति के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट होता है और एक लेक्सा प्रोटीन एक अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (टीएपी) टैग से जुड़ा होता है। आर-रीकॉम्बिनेज के शामिल होने के बाद, एंजाइम एक परिपत्र क्रोमैटिन डोमेन के रूप में गुणसूत्र से लक्षित क्षेत्र को कुशलता से उत्तेजित करता है। इस डोमेन को लेक्सा-टीएपी एडाप्टर प्रोटीन के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है, जो लेक्सा डीएनए बाध्यकारी साइटों के साथ-साथ एक आत्मीयता समर्थन के लिए बांधता है। इस विधि हाल ही में खमीर गुणसूत्र III13 के चयनित प्रतिकृति मूल युक्त अलग क्रोमैटिन डोमेन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
इस पूर्व विवो दृष्टिकोण का एक बड़ा लाभ यह है कि यह पृथक सामग्री के कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, प्रतिकृति मूल डोमेन इस विधि के साथ शुद्ध इन विट्रो प्रतिकृति assays में विवो इकट्ठे क्रोमेटिन टेम्पलेट्स में देशी से एक टेस्ट ट्यूब में मूल फायरिंग की दक्षता का आकलन करने के अधीन किया जा सकता है. अंततः, पृथक सामग्री का जैव रासायनिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन देशी क्रोमैटिन टेम्पलेट के साथ शुद्ध प्रोटीन का उपयोग करके परमाणु प्रक्रियाओं के पुनर्गठन की अनुमति दे सकता है। सारांश में, यह पद्धति क्रोमैटिन अनुसंधान में एक रोमांचक एवेन्यू खोलती है, क्योंकि एक निश्चित गुणसूत्र लेनदेन से गुजरने वाले एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र के सामूहिक संरचना और संरचनात्मक क्रोमैटिन परिवर्तनों का पालन करना संभव होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
कारकों और एक विशिष्ट लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र के क्रोमेटिन परिदृश्य की पहचान क्रोमेटिन अनुसंधान18 में एक बड़ी चुनौती पैदा करने के लिए जारी है. यह प्रोटोकॉल खमीर गुणसूत्रों से अलग-अलग क्रोमैटिन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसएच प्रयोगशाला में काम को डीएफजी द्वारा SFB1064 (प्रोजेक्ट आईडी 213249687), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी स्टार्टिंग ग्रांट 852798 कॉन्फ्लिक्टरिज़ॉल्यूशन), और हेल्महोल्ट्ज़ गेसेलशाफ्ट के माध्यम से समर्थित किया गया था।
Materials
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
References
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