Justering af synkroniserede tidsseriedata ved hjælp af den karakteristiske synkroniseringsmodel for tab af cellecyklus til sammenligninger på tværs af eksperimenter
Summary
En udfordring ved at analysere synkroniserede tidsserieeksperimenter er, at eksperimenterne ofte adskiller sig i længden af genopretning fra synkronisering og cellecyklusperioden. Målingerne fra forskellige eksperimenter kan således ikke analyseres samlet eller let sammenlignes. Her beskriver vi en metode til justering af eksperimenter for at muliggøre fasespecifikke sammenligninger.
Abstract
Undersøgelse af cellecyklussen afhænger ofte af synkronisering af cellepopulationer for at måle forskellige parametre i en tidsserie, når cellerne krydser cellecyklussen. Men selv under lignende forhold viser replikerede eksperimenter forskelle i den tid, der kræves for at komme sig efter synkroni og krydse cellecyklussen, hvilket forhindrer direkte sammenligninger på hvert tidspunkt. Problemet med at sammenligne dynamiske målinger på tværs af eksperimenter forværres i mutante populationer eller i alternative vækstbetingelser, der påvirker synkroniseringsrestitutionstiden og/eller cellecyklusperioden.
Vi har tidligere udgivet en parametrisk matematisk model ved navn Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS), der overvåger, hvordan synkrone populationer af celler frigives fra synkroni og skrider frem gennem cellecyklussen. De lærte parametre fra modellen kan derefter bruges til at konvertere eksperimentelle tidspunkter fra synkroniserede tidsserieeksperimenter til en normaliseret tidsskala (livlinepunkter). I stedet for at repræsentere den forløbne tid i minutter fra eksperimentets start, repræsenterer livlineskalaen progressionen fra synkroni til cellecyklusindgang og derefter gennem cellecyklusfaserne. Da livlinepunkter svarer til fasen af den gennemsnitlige celle inden for den synkroniserede population, giver denne normaliserede tidsskala mulighed for direkte sammenligninger mellem eksperimenter, herunder dem med varierende perioder og restitutionstider. Desuden er modellen blevet brugt til at justere cellecykluseksperimenter mellem forskellige arter (f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe), hvilket muliggør direkte sammenligning af cellecyklusmålinger, hvilket kan afsløre evolutionære ligheder og forskelle.
Introduction
Tidsseriemålinger foretaget på synkroniserede populationer af celler, når de skrider frem gennem cellecyklussen, er en standardmetode til undersøgelse af de mekanismer, der styrer cellecyklusprogression 1,2,3,4,5,6,7,8 . Evnen til at foretage sammenligninger på tværs af synkroni/frigivelsestidsserieeksperimenter er afgørende for vores forståelse af disse dynamiske processer. Brugen af replikate eksperimenter til at bekræfte resultaterne kan øge tilliden til reproducerbarheden af konklusionerne. Desuden kan sammenligninger mellem miljøforhold, på tværs af mutanter og endda mellem arter afdække mange nye indsigter i cellecyklusregulering. Intereksperimentel variabilitet i genopretningen fra synkroni og i hastigheden af cellecyklusprogression forringer imidlertid evnen til at foretage tidspunkt-til-tid-sammenligninger på tværs af replikater eller mellem eksperimenter med ændret cellecyklustiming. På grund af disse udfordringer er replikater ofte ikke inkluderet i fuldtidsserien (f.eks. Spellman et al.4). Når replikater for hele tidsserien indsamles, kan dataene ikke analyseres samlet, men snarere bruges en enkelt replikat til analyse, og andre replikater henvises ofte til supplerende tal (f.eks. Orlando et al.8). Desuden er sammenligninger mellem eksperimenter med forskellige restitutions- eller cellecyklusprogressionskarakteristika vanskelige. Målingerne af mindre intervaller mellem en hændelse af interesse og et cellecyklusmærke (f.eks. knoppefremkomst, S-faseindgang eller anafasedebut) kan hjælpe med at reducere fejl, hvis disse skelsættende hændelser spores 1,2,3,9,10,11,12. Imidlertid kan subtile, men vigtige forskelle forblive uopdagede eller tilslørede ved hjælp af disse ad hoc-metoder. Endelig giver enkeltcelleanalyser mulighed for at analysere cellecyklusprogression uden at stole på synkronisering eller justering13, selvom store målinger i enkeltcelleundersøgelser kan være udfordrende og dyre.
For at overvinde disse vanskeligheder udviklede vi CLOCCS-modellen (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) for at hjælpe med analysen af tidsseriemålinger foretaget på synkroniserede populationer14,15. CLOCCS er en fleksibel matematisk model, der beskriver fordelingen af synkroniserede celler på tværs af cellecyklusfaser, når de frigives fra synkronisering og skrider frem gennem cellecyklussen. Forgreningsprocesrammen gør det muligt for modellen at redegøre for de asymmetriske kvaliteter af moder- og datterceller efter deling, som observeret i S. cerevisiae, mens den stadig er nyttig for organismer, der deler sig ved fission, såsom S. pombe. Modellen kan tage input fra et forskelligt sæt måletyper for at angive cellecyklusfasen. Det kan indtage spirende cellecyklusfasedata, som inkluderer målinger af de procentudstødte celler over tid, hvilket giver mulighed for estimering af antallet af celler uden for den unbudded G1 fase14,15. Modellen kan også indtage flowcytometriske data, der måler DNA-indholdet, hvilket muliggør vurdering af skelsættende overgange fra G1 til S, S til G2 og M til G115. Fluorescerende morfologiske markører kan også bruges til at identificere cellecyklusfasen. Den fluorescerende mærkning af myosinringe, kerner og spindelpollegemer (SPB’er) kan bruges til at bestemme cellecyklusfasen, og disse blev indarbejdet i CLOCCS model11; Disse målinger vil dog ikke blive beskrevet i denne protokol. Derudover blev septationsindekset brugt som input til modellering af data fra S. pombe14. Modellen kan således bruges til cellecyklusanalyser i en række forskellige organismer og kan udvides yderligere.
CLOCCS er en parametrisk model, der giver mulighed for den fulde bayesianske slutning af flere parametre fra inputdataene (f.eks. spirende procentdel, DNA-indhold). Disse parametre omfatter restitutionstiden fra synkroni, længden af cellecyklusperioden (estimeret separat for moder- og datterceller) og cellernes gennemsnitlige cellecyklusposition på hvert tidspunkt. Disse parametre repræsenterer adfærden af den gennemsnitlige celle i befolkningen, hvilket gør det muligt for forskeren at kortlægge hvert tidspunkt til en cellecyklusposition udtrykt som et livlinepunkt. Omregningen til livlinepunkter afhænger af CLOCCS-parametrene lambda (λ) og mu0 (μ0)14,15. Parameteren λ svarer til modercellernes gennemsnitlige cellecyklusperiode. På grund af mor-datter-forsinkelsen14,15 er dette imidlertid ikke den gennemsnitlige cellecyklusperiode for hele befolkningen, der inkluderer både moder- og dattercellerne. CLOCCS udleder desuden parameteren delta (δ), som svarer til mor-datter-forsinkelsen og dermed gør det muligt at beregne den gennemsnitlige cellecyklusperiode for hele befolkningen. Endelig, fordi hvert eksperiment begynder efter frigivelse fra cellecyklussynkronisering, repræsenteres den tid, der kræves for at komme sig fra synkroniseringsmetoden, af CLOCCS-parameteren μ0. CLOCCS tilpasser en model til inputcellecyklusfasedataene og udleder derefter disse parametre ved hjælp af en tilfældig gang Markov-kæde Monte Carlo-algoritme14,15. Ved at kortlægge flere eksperimenter til en fælles cellecyklus livline tidsskala, kan der foretages direkte fasespecifikke sammenligninger mellem replikater eller eksperimenter, hvor restitutionstiden eller cellecyklusperioderne ikke er identiske 8,14,15.
Da synkroniserede populationer mister synkronisering med en vis hastighed i løbet af tidsserien14,15,16,17, kan variabilitet i hastigheden af synkroniseringstab også hæmme kvantitative sammenligninger på tværs af eksperimenter. Ved at identificere placeringen af populationer og variansen i deres fordelinger tegner CLOCCS sig for forskelle i frekvenser af synkront tab. Dette kraftfulde værktøj giver mulighed for specifikke og detaljerede sammenligninger på tværs af eksperimenter, hvilket giver mulighed for direkte at foretage relevante sammenligninger ikke kun mellem replikater, men også mellem miljøforhold, mutanter og endda arter, der har dramatisk forskellige cellecyklustidspunkter14,15.
Dette papir beskriver en metode, der bruger CLOCCS til at estimere parametre ved at tilpasse data fra synkron-/frigivelsestidsserieeksperimenter, kortlægge dataene til en fælles livlineskala og derefter foretage relevante sammenligninger mellem replikater eller eksperimenter. Justering af livliner giver mulighed for direkte fasespecifikke sammenligninger på tværs af disse eksperimenter, hvilket giver mulighed for aggregering og sammenligning af replikater og for at foretage mere relevante sammenligninger på tværs af eksperimenter med forskellige restitutionstider og cellecyklusperioder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir præsenterer en metode til mere præcist og kvantitativt at vurdere data fra tidsserieeksperimenter på synkroniserede populationer af celler. Metoden udnytter indlærte parametre fra CLOCCS, en bayesiansk inferensmodel, der bruger inputcellecyklusfasedata, såsom spirende data og flowcytometriske DNA-indholdsdata, til at parameterisere hvert eksperiment14,15. CLOCCS bruger inputcellecyklusfasedataene til at udlede parametrene for hvert eksperiment, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione og S. Haase blev støttet af midler fra National Science Foundation (DMS-1839288) og National Institutes of Health (5R01GM126555). Derudover vil forfatterne gerne takke Huarui Zhou (Duke University) for kommentarer til manuskriptet og for beta-test af protokollen. Vi takker også Francis Motta (Florida Atlantic University) og Joshua Robinson for deres hjælp med Java-koden.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
References
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
