Allineamento di dati di serie temporali sincronizzati utilizzando il modello caratterizzante della perdita di sincronia del ciclo cellulare per confronti cross-experiment
Summary
Una sfida nell’analizzare gli esperimenti sincronizzati di serie temporali è che gli esperimenti spesso differiscono nella durata del recupero dalla sincronia e nel periodo del ciclo cellulare. Pertanto, le misurazioni di diversi esperimenti non possono essere analizzate in forma aggregata o facilmente confrontate. Qui, descriviamo un metodo per allineare gli esperimenti per consentire confronti specifici di fase.
Abstract
Lo studio del ciclo cellulare spesso dipende dalla sincronizzazione delle popolazioni cellulari per misurare vari parametri in una serie temporale mentre le cellule attraversano il ciclo cellulare. Tuttavia, anche in condizioni simili, gli esperimenti replicati mostrano differenze nel tempo necessario per recuperare dalla sincronia e attraversare il ciclo cellulare, impedendo così confronti diretti in ogni punto temporale. Il problema di confrontare le misurazioni dinamiche tra gli esperimenti è esacerbato nelle popolazioni mutanti o in condizioni di crescita alternative che influenzano il tempo di recupero della sincronia e / o il periodo del ciclo cellulare.
Abbiamo precedentemente pubblicato un modello matematico parametrico chiamato Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) che monitora come le popolazioni sincrone di cellule si liberano dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. I parametri appresi dal modello possono quindi essere utilizzati per convertire i punti temporali sperimentali da esperimenti di serie temporali sincronizzati in una scala temporale normalizzata (punti della linea di vita). Piuttosto che rappresentare il tempo trascorso in minuti dall’inizio dell’esperimento, la scala della linea di vita rappresenta la progressione dalla sincronia all’ingresso del ciclo cellulare e quindi attraverso le fasi del ciclo cellulare. Poiché i punti vitali corrispondono alla fase della cellula media all’interno della popolazione sincronizzata, questa scala temporale normalizzata consente confronti diretti tra esperimenti, compresi quelli con periodi e tempi di recupero variabili. Inoltre, il modello è stato utilizzato per allineare gli esperimenti sul ciclo cellulare tra diverse specie (ad esempio, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe), consentendo così il confronto diretto delle misurazioni del ciclo cellulare, che possono rivelare somiglianze e differenze evolutive.
Introduction
Le misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate di cellule mentre progrediscono attraverso il ciclo cellulare sono un metodo standard per studiare i meccanismi che controllano la progressione del ciclo cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacità di effettuare confronti tra esperimenti di sincronia / rilascio di serie temporali è vitale per la nostra comprensione di questi processi dinamici. L’uso di esperimenti replicati per corroborare i risultati può aumentare la fiducia nella riproducibilità delle conclusioni. Inoltre, i confronti tra le condizioni ambientali, tra i mutanti e persino tra le specie possono rivelare molte nuove intuizioni sulla regolazione del ciclo cellulare. Tuttavia, la variabilità intersperimentale nel recupero dalla sincronia e nella velocità di progressione del ciclo cellulare compromette la capacità di effettuare confronti punto-tempo-a-punto tra repliche o tra esperimenti con tempi alterati del ciclo cellulare. A causa di queste sfide, le repliche spesso non sono incluse per le serie temporali complete (ad esempio, Spellman et al.4). Quando vengono raccolte le repliche per l’intera serie temporale, i dati non possono essere analizzati in forma aggregata, ma piuttosto una singola replica viene utilizzata per l’analisi e altre repliche sono spesso relegate a cifre supplementari (ad esempio, Orlando et al.8). Inoltre, i confronti tra esperimenti con diverse caratteristiche di recupero o progressione del ciclo cellulare sono difficili. Le misurazioni di intervalli più piccoli tra un evento di interesse e un punto di riferimento del ciclo cellulare (ad esempio, emergenza delle gemme, ingresso della fase S o insorgenza dell’anafase) possono aiutare a ridurre gli errori se questi eventi di riferimento sono tracciati 1,2,3,9,10,11,12. Tuttavia, differenze sottili ma importanti possono rimanere inosservate o oscurate utilizzando questi metodi ad hoc. Infine, le analisi a singola cellula consentono di analizzare la progressione del ciclo cellulare senza fare affidamento sulla sincronizzazione o sull’allineamento13, sebbene le misurazioni su larga scala negli studi a singola cellula possano essere impegnative e costose.
Per superare queste difficoltà, abbiamo sviluppato il modello CLOCCS (Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) per aiutare l’analisi delle misurazioni di serie temporali effettuate su popolazioni sincronizzate14,15. CLOCCS è un modello matematico flessibile che descrive la distribuzione delle cellule sincronizzate attraverso le fasi del ciclo cellulare mentre vengono rilasciate dalla sincronia e progrediscono attraverso il ciclo cellulare. La struttura del processo di ramificazione consente al modello di spiegare le qualità asimmetriche delle cellule madri e figlie dopo la divisione, come osservato in S. cerevisiae, pur essendo utile per gli organismi che si dividono per fissione, come S. pombe. Il modello può prendere input da una serie diversificata di tipi di misurazione per specificare la fase del ciclo cellulare. Può ingerire dati di fase del ciclo cellulare in erba, che includono misurazioni della percentuale di cellule gemmate nel tempo, consentendo la stima del numero di cellule al di fuori della fase G1 non gemmata14,15. Il modello può anche acquisire dati citometrici a flusso che misurano il contenuto di DNA, consentendo così la valutazione delle transizioni di riferimento da G1 a S, S a G2 e da M a G115. I marcatori morfologici fluorescenti possono anche essere utilizzati per identificare la fase del ciclo cellulare. La marcatura fluorescente degli anelli della miosina, dei nuclei e dei corpi dei poli del fuso (SPB) può essere utilizzata per determinare la fase del ciclo cellulare, e questi sono stati incorporati nel modello CLOCCS11; Tuttavia, queste misurazioni non saranno descritte in questo protocollo. Inoltre, l’indice di settazione è stato utilizzato come input per la modellazione dei dati di S. pombe14. Pertanto, il modello può essere utilizzato per analisi del ciclo cellulare in una varietà di organismi e può essere ulteriormente ampliato.
CLOCCS è un modello parametrico che consente l’inferenza bayesiana completa di più parametri dai dati di input (ad esempio, percentuale di gemmazione, contenuto di DNA). Questi parametri includono il tempo di recupero dalla sincronia, la lunghezza del periodo del ciclo cellulare (stimato separatamente per le cellule madri e figlie) e la posizione media del ciclo cellulare delle cellule in ciascun punto temporale. Questi parametri rappresentano il comportamento della cellula media nella popolazione, consentendo al ricercatore di mappare ogni punto temporale una posizione del ciclo cellulare espressa come punto di vita. La conversione in punti linea vita dipende dai parametri CLOCCS lambda (λ) e mu0 (μ0)14,15. Il parametro λ corrisponde al periodo medio del ciclo cellulare delle cellule madri. Tuttavia, a causa del ritardo madre-figlia14,15, questo non è il periodo medio del ciclo cellulare dell’intera popolazione che include sia le cellule madri che quelle figlie. CLOCCS deduce inoltre il parametro delta (δ), che corrisponde al ritardo madre-figlia e, quindi, consente il calcolo del periodo medio del ciclo cellulare dell’intera popolazione. Infine, poiché ogni esperimento inizia dopo il rilascio dalla sincronizzazione del ciclo cellulare, il tempo necessario per il ripristino dal metodo di sincronizzazione è rappresentato dal parametro CLOCCS μ0. CLOCCS adatta un modello ai dati di fase del ciclo cellulare di input e quindi deduce questi parametri utilizzando un algoritmo Monte Carlo a catena di Markov a camminata casuale14,15. Mappando più esperimenti su una scala temporale comune del ciclo di vita cellulare, è possibile effettuare confronti diretti specifici di fase tra repliche o esperimenti in cui il tempo di recupero o i periodi del ciclo cellulare non sono identici 8,14,15.
Poiché le popolazioni sincronizzate perdono sincronia ad un certo ritmo nel corso delle serie temporali14,15,16,17, la variabilità nel tasso di perdita di sincronia può anche impedire confronti quantitativi tra esperimenti. Identificando la posizione delle popolazioni e la varianza nelle loro distribuzioni, CLOCCS tiene conto delle differenze nei tassi di perdita di sincronia. Questo potente strumento consente confronti specifici e dettagliati tra esperimenti, fornendo così la possibilità di effettuare direttamente confronti rilevanti non solo tra repliche ma anche tra condizioni ambientali, mutanti e persino specie che hanno tempi del ciclo cellulare drammaticamente diversi14,15.
Questo documento descrive un metodo che utilizza CLOCCS per stimare i parametri adattando i dati da esperimenti di serie temporali di sincronia/rilascio, mappare i dati su una scala di linea di vita comune e quindi effettuare confronti pertinenti tra repliche o esperimenti. L’allineamento della linea di vita consente confronti diretti specifici di fase tra questi esperimenti, che consentono l’aggregazione e il confronto delle repliche e di effettuare confronti più pertinenti tra esperimenti con diversi tempi di recupero e periodi del ciclo cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un metodo per valutare in modo più accurato e quantitativo i dati provenienti da esperimenti di serie temporali su popolazioni sincronizzate di cellule. Il metodo utilizza i parametri appresi da CLOCCS, un modello di inferenza bayesiana che utilizza i dati di fase del ciclo cellulare di input, come i dati di gemmazione e i dati del contenuto di DNA citometrico a flusso, per parametrizzare ogni esperimento14,15. CLOCCS utilizza i dati di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione e S. Haase sono stati sostenuti da finanziamenti della National Science Foundation (DMS-1839288) e del National Institutes of Health (5R01GM126555). Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Huarui Zhou (Duke University) per i commenti sul manoscritto e per il beta testing del protocollo. Ringraziamo anche Francis Motta (Florida Atlantic University) e Joshua Robinson per il loro aiuto con il codice Java.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
References
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
