检查点抑制剂是开发抗癌疗法的重要靶点。本报告介绍了一种新型基于 PDL1 肽的癌症疫苗 PDL1-Vaxx,它诱导中和多克隆抗体的产生,从而阻断 PD-1/PDL1 复合物的形成。这项工作还详细介绍了用于分析这种活性的基于荧光珠的测定法的开发和测试。
用单克隆抗体抑制检查点受体(PD-1、PD-L1 和 CTLA-4)在治疗癌症患者的临床试验中显示出极大的益处,并已成为现代癌症免疫治疗的主要方法。然而,只有一部分患者对检查点单克隆抗体免疫治疗有反应。因此,开发新的癌症治疗策略是当务之急。已经开发出一种新型 B 细胞肽表位 PDL1(程序性死亡配体 1)癌症疫苗,氨基酸 130-147 通过 GPSL 连接子与 MVF 肽(“混杂”T 细胞麻疹病毒融合蛋白)连接。临床前测试表明,这种PDL1疫苗(PDL1-Vaxx)可有效刺激动物体内的高免疫原性抗体。用 PDL1-Vaxx 免疫的动物在各种动物癌症模型中显示出肿瘤负荷降低和存活率延长。作用机制表明,疫苗引发的抗体抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,并阻断PD-1/PD-L1相互作用。本文介绍了一种基于磁珠的检测方法,该检测方法使用双报告分子流分析系统来评估 PD-1/PD-L1 相互作用及其被针对 PDL1-Vaxx 的抗 PDL1 抗体阻断。
在免疫系统的 T 细胞、B 细胞和细胞内检查点中,信号通路调节免疫活动。一些癌细胞通过刺激检查点靶点来保护自己免受免疫攻击,从而抑制免疫功能并促进肿瘤存活和增殖。通过检查点抑制的肿瘤免疫疗法使用抗体来靶向和阻断信号检查点,从而恢复免疫系统的抗肿瘤功能 1,2,3。目前有效的抗癌疗法包括靶向程序性死亡蛋白 1 (PD-1)4 的单克隆抗体 nivolumab 和靶向程序性死亡配体 1 (PD-L1)5 的阿替利珠单抗。这种方法在治疗癌症患者方面取得了巨大的临床成功。然而,不良事件和治疗耐药性减轻了当前检查点抑制策略的临床效用,尤其是在单药治疗中6。在癌症治疗中,迫切需要免疫疗法和更有效的低毒性治疗策略的结合1,3,6。
在过去的 30 年里,Kaumaya 博士的实验室开发了用于癌症治疗的肽癌疫苗和肽模拟物相关药物,其中一些正在进行临床试验 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 .例如,B-Vaxx 与 HER-2 联合免疫疗法在临床试验中显示出对转移性和/或复发性实体瘤的益处12.该实验室最新的癌症疫苗是PD1-Vaxx 2,13和PDL1-Vaxx14,它们在临床前研究中显示出巨大的优势,特别是在联合治疗方面。PD1-Vaxx已在美国和澳大利亚完成了剂量递增临床试验。PD1-Vaxx 将在 2023 年 5 月开始的 1b 期试验中与阿替利珠单抗联合使用。本报告重点评估 PDL1-Vaxx 诱导的抗体阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的能力。
PDL1-Vaxx 癌症疫苗是一种新型 B 细胞肽表位疫苗,其中 PD-L1 氨基酸 130-147 通过 GPSL 肽连接子与混杂 T 细胞麻疹病毒融合 (MVF) 肽相连。临床前研究表明,PDL1-Vaxx 在刺激各种动物模型中产生抗癌抗体、延长生存期并减轻肿瘤负荷方面具有高度免疫原性14。这些针对 PD-L1 肽产生的抗体可以成功阻断 PD1/PD-L1 相互作用,从而产生抗肿瘤活性。本报告介绍了一种检测方法,该检测方法使用基于磁珠的格式和 流式细胞术仪器上的双报告基因读数来分析 PDL1-Vaxx 诱导的抗体对 PD1/PD-L1 复合物形成的阻断。
检查点相关癌症免疫疗法的目的是破坏检查点蛋白与其重要配体在肿瘤存活和进展中的相互作用2.该研究小组正在积极开发新型 PD-1 和 PD-L1 疫苗,这些疫苗可引发靶向和中断 PD-1/PD-L1 检查点 3,8,13,14 的抗体反应。此前,进行了两种酶联免疫吸附测定 (ELISA) 来评估抗 PDL1 肽抗体对抑制重组 PD1/PD-L1 相互作用的影响14。(1)在第一种变体中,将rhPD-L1包被在微量滴定板上,然后用稀释的抗PDL1候选疫苗诱导抗体孵育该板。然后通过添加生物素化的 rhPD-1 并使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物和比色底物定量与固定化的 rhPD-L1 的结合来评估抗体对重组 PD-1/PD-L1 相互作用的抑制。我们将其定义为直接阻断试验。(2)在第二种变体中,PD-1被涂覆在微量滴定板上。生物素化的 rhPD-L1 与每种抗 PLD1 候选诱导的多克隆抗体在单独的反应管中预孵育。然后将 rhPDL1/抗 PDL1 混合物加入到含有固定化 rhPD-1 的板孔中并使其反应。在随后的链霉亲和素-HRP 和比色底物孵育中检测到在潜在阻断 PDL1-Vaxx 诱导的抗体存在下与固定化 rhPD-1 反应的任何 rhPDL1。我们将其定义为反向阻断试验。
抗PDL1肽抗体对重组PD-1/PD-L1相互作用的反向阻断显示出对信号的抑制(即PD-1/PD-L1阻断)以抗体浓度依赖性的方式14,而直接阻断方法没有提供一致的结果(未显示)。开发了基于微珠的双报告基因阻断试验,以验证 ELISA 结果并研究流体相中 PD-1/PD-L1 相互作用的阻断,从而消除了与固定重组蛋白在井底相关的潜在空间位阻/结合表位可用性问题。微球分析与使用反向阻断试验的ELISA阻断结果直接相关(图2)。此外,与比色 ELISA18 相比,基于荧光的免疫测定可以提供更高的检测灵敏度和更宽的动态范围,此外,基于微珠的多重检测允许在一次反应中同时进行两种独立的免疫测定。用于微球与rhPD-1共价偶联的磺基-NHS和EDC可能导致直接封闭和反向封闭试验之间的性能差异,以及ELISA和基于Luminex微球的重组PD-1/PD-L1相互作用试验之间观察到的灵敏度差异。有必要进行进一步的化学和分子水平研究,以研究造成这些差异的可能机制。
ELISA14 和基于微珠的检测均表明,PDL1-Vaxx 诱导的抗 PDL1 抗体可以抑制 PD1/PD-L1 检查点复合物的形成。基于肽的 PDL1-Vaxx 成功诱导可阻断 PD-1/PD-L1 相互作用的抗 PDL1 抗体。这种方法可以作为治疗癌症的一种新治疗策略,正如临床前动物研究所支持的那样 3,13,14。计划中的临床试验将确定 PDL1-Vaxx 对癌症患者检查点免疫治疗和疾病控制的疗效。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢 Luminex Corporation(德克萨斯州奥斯汀)的 MBA Sherry Dunbar 博士的研究支持,以及 Biomedical Publishing Solutions(佛罗里达州巴拿马城;mattsilver@yahoo.com 年)的 Matthew Silverman 博士提供的科学和写作帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院(R21 CA13508 和 R01 CA84356)和澳大利亚悉尼 Imugene Ltd(OSU 900600、GR110567 和 GR124326)的 Pravin TP Kaumaya 的奖项支持。
Buffers | |||
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 | Millipore/Sigma | S3139 | |
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) | Millipore/Sigma | P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide) | |
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 | MilliporeSigma | M2933 | |
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 77149 | |
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: | Luminex Corp. (Austin, TX) | 40-50016 | |
EDC, 10 mg | |||
sNHS solution, 250 µL | |||
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0 | |||
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN) | |||
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | |||
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) | Luminex Corp. (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO | |
Low protein-binding round bottom 96-well plate | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 07-200-761 | |
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0269-01 | |
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0288-01 | |
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp. (Austin, TX) | MC-1**** (varies by bead label) | |
Protein LoBind microcentrifuge tubes | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 022431081 | |
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents | |||
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) | |
Biotinylated recombinant human PDL1 | Sino Biological (Wayne, PA) | 10084-H49H-B | |
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 709-675-149 | |
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 711-675-152 | |
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) | Acro Biosystems (Newark, DE) | PD1-H5256 | |
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) | Agilent (Santa Clara, CA) | PJRS34-1 | |
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) |