JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Generering av sentromerassosiert protein-E CENP-E-/- Knockout-cellelinjer ved bruk av CRISPR/Cas9-systemet

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Denne artikkelen rapporterer konstruksjonen av sentromerassosiert protein-E (CENP-E) knockoutceller ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet og tre fenotypebaserte screeningstrategier. Vi har benyttet CENP-E knockout-cellelinjen for å etablere en ny tilnærming for å validere spesifisiteten og toksisiteten til CENP-E-hemmerne, noe som er nyttig for stoffutvikling og biologisk forskning.

Abstract

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet har dukket opp som et kraftig verktøy for presis og effektiv genredigering i en rekke organismer. Centromere-associated protein-E (CENP-E) er en pluss-ende-rettet kinesin som kreves for kinetochore-mikrotubuli fangst, kromosomjustering og spindelmonteringskontrollpunkt. Selv om cellulære funksjoner av CENP-E-proteinene har blitt godt studert, har det vært vanskelig å studere de direkte funksjonene til CENP-E-proteiner ved hjelp av tradisjonelle protokoller fordi CENP-E-ablasjon vanligvis fører til spindelmonteringskontrollpunktaktivering, cellesyklusarrest og celledød. I denne studien har vi fullstendig slått ut CENP-E-genet i humane HeLa-celler og vellykket generert CENP-E-/- HeLa-cellene ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet.

Tre optimaliserte fenotypebaserte screeningsstrategier ble etablert, inkludert cellekoloniscreening, kromosomjusteringsfenotyper og fluorescerende intensiteter av CENP-E-proteiner, som effektivt forbedrer screeningseffektiviteten og eksperimentell suksessrate for CENP-E knockoutcellene . Det er viktig at CENP-E-delesjon resulterer i kromosomfeiljustering, den unormale plasseringen av BUB1 mitotisk sjekkpunkt serin / treoninkinase B (BubR1) proteiner og mitotiske defekter. Videre har vi benyttet CENP-E knockout HeLa-cellemodellen for å utvikle en identifikasjonsmetode for CENP-E-spesifikke hemmere.

I denne studien er det etablert en nyttig tilnærming for å validere spesifisiteten og toksisiteten til CENP-E-hemmere. Videre presenterer denne artikkelen protokollene for CENP-E-genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet, som kan være et kraftig verktøy for å undersøke mekanismene til CENP-E i celledeling. Videre vil CENP-E knockout-cellelinjen bidra til oppdagelsen og valideringen av CENP-E-hemmere, som har viktige implikasjoner for utvikling av antitumormedikamenter, studier av celledelingsmekanismer i cellebiologi og kliniske applikasjoner.

Introduction

Konstruert genomredigering formidler de målrettede modifikasjonene av gener i en rekke celler og organismer. I eukaryoter kan stedsspesifikk mutagenese introduseres ved anvendelser av sekvensspesifikke nukleaser som stimulerer homolog rekombinasjon av mål-DNA1. I de senere år har flere genomredigeringsteknologier, inkludert sinkfingernukleaser (ZFN) 2,3, transkripsjonsaktivatorlignende effektornukleaser (TALENs) 4,5 og homing meganucleases 6,7, blitt konstruert for å spalte genomer på bestemte steder, men disse tilnærmingene krever kompleks proteinteknikk og overflødige eksperimentelle prosedyrer. Studier har vist at type II prokaryote grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas-systemet er en effektiv genredigeringsteknologi, som spesifikt formidler RNA-guidet, stedsspesifikk DNA-spaltning i et bredt spekter av celler og arter 8,9,10,11. CRISPR/Cas9-genknockoutteknologien har revolusjonert feltene grunnleggende biologi, bioteknologi og medisin12.

Bakterier og de fleste archaea har utviklet et RNA-basert adaptivt immunsystem som bruker CRISPR- og Cas-proteiner for å identifisere og ødelegge virus og plasmider13. Streptokokker pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuklease inneholder RuvC-lignende Holliday junction resolvase (RuvC) og His-Asn-His (HNH) domene, som effektivt kan formidle sekvensspesifikke, dobbeltstrengede pauser (DSB) ved å tilby et syntetisk enkeltstyre-RNA (sgRNA) som inneholder CRISPR RNA (crRNA) og transaktiverende crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB kan repareres gjennom den indeldannende ikke-homologe endekoblingen (NHEJ) eller homologirettet reparasjonsvei (HDR), som introduserer flere mutasjoner, inkludert innsettinger, delesjoner eller arrfrie enkeltnukleotidsubstitusjoner, i pattedyrceller 1,8. Både den feilutsatte NHEJ og HDR-banen med høy kvalitet kan brukes til å formidle genknockout gjennom innsettinger eller delesjoner, noe som kan forårsake frameshift-mutasjoner og for tidlig stoppkodon10.

Kinesin-7 CENP-E er nødvendig for kinetochore-microtubule vedlegg og kromosomjustering under celledeling 17,18,19. Antistoffmikroinjeksjon20,21, siRNA-uttømming22,23, kjemisk hemming 24,25,26 og genetisk delesjon 27,28,29 av CENP-E fører til kromosomfeiljustering, aktivering av spindelmonteringskontrollpunkt og mitotiske defekter, noe som resulterer i aneuploidi og kromosomal ustabilitet19,30. Hos mus resulterer CENP-E-delesjon i unormal utvikling og embryonal dødelighet i de tidlige utviklingsstadiene 27,29,31. Genetisk delesjon av CENP-E fører vanligvis til kromosomfeilstilling og celledød 26,27,29, som er et hinder for å studere funksjonene og mekanismene til CENP-E-proteinene.

En nylig studie har etablert en betinget CENP-E knockout-cellelinje ved hjelp av en Auxin-induserbar CRISPR / Cas9-genredigeringsmetode32, som muliggjør rask nedbrytning av CENP-E-proteiner på relativt kort tid33. Til dags dato er det imidlertid ikke etablert stabile CENP-E knockoutcellelinjer, noe som er en uløst teknisk utfordring i CENP-E-biologi. Tatt i betraktning genetisk robusthet34, genetiske kompensasjonsresponser 35,36,37 og komplekse intracellulære miljøer, da de direkte konsekvensene av fullstendig sletting av CENP-E kan være komplekse og uforutsigbare, er det viktig å etablere CENP-E knockoutcellelinjer for undersøkelse av mekanismer for kromosomjustering, spindelmonteringskontrollpunkt og nedstrøms signalveier.

Oppdagelsen og anvendelsen av CENP-E-hemmere er viktig for kreftbehandling. Til dags dato har syv typer CENP-E-hemmere blitt funnet og syntetisert, inkludert GSK923295 og dets derivater24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridinstillasderivater40,41, forbindelse-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 og benzo[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolderivater47. Blant disse hemmerne er GSK923295 en allosterisk og effektiv CENP-E-hemmer som binder seg til det motoriske domenet til CENP-E og hemmer CENP-E mikrotubuli-stimulert ATPase-aktivitet med en Ki på 3,2 ± 0,2 nM24,25. Imidlertid, sammenlignet med de hemmende effektene av GSK923295 på dyrkede kreftceller, er de terapeutiske effektene av GSK923295 hos kliniske kreftpasienter ikke ideelle48,49, noe som også reiste bekymringer om spesifisiteten til GSK923295 for CENP-E. Videre er spesifisiteten og bivirkningene av andre CENP-E-hemmere på CENP-E-proteinene sentrale spørsmål i kreftforskning.

I denne studien har vi fullstendig slått ut CENP-E-genet i HeLa-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet. Tre optimaliserte fenotypebaserte screeningsstrategier er etablert, inkludert cellekoloniscreening, kromosomjusteringsfenotyper og fluorescerende intensiteter av CENP-E-proteiner, for å forbedre screeningseffektiviteten og suksessraten for CENP-E-genredigering. Videre kan CENP-E knockoutcellelinjer brukes til å teste spesifisiteten til kandidatforbindelser for CENP-E.

Protocol

1. Konstruksjon av CRISPR/Cas9 genknockoutvektorer Velg målgenomisk DNA-sekvens på det humane CENP-E-genet (GenBank Accession nr. NM_001286734.2) og design sgRNA ved hjelp av et online CRISPR-designverktøy (http://crispor.tefor.net/). Skriv inn en enkelt genomisk sekvens, velg genomet til “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysesett) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148”, og velg protospacer tilstøtende motiv “20 bp-NGG-spCas9”. Velg to guide…

Representative Results

CENP-E-/- HeLa-cellene ble vellykket generert ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet (figur 1). Tidslinjen og kritiske eksperimentelle trinn for denne metoden er vist i figur 1. Først designet og syntetiserte vi CENP-E-spesifikke sgRNAer, glødet og ligerte sgRNAene til pX458-plasmidet, transfektet plasmidet til HeLa-celler og dyrket dem i 48 timer. De transfekterte cellene ble dissosiert og sådd i en 96-brønns plate ved hjelp av serie…

Discussion

Kinesin-7 CENP-E er en nøkkelregulator i kromosomjustering og spindelmonteringskontrollpunkt under celledeling 17,19,20. Genetisk sletting av CENP-E resulterer vanligvis i aktivering av spindelmonteringskontrollpunkt, cellesyklusarrest og celledød 27,29,51,52. Dermed er konstruksjonen av stabile …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer av Cytoskeleton Laboratory ved Fujian Medical University for nyttige diskusjoner. Vi takker Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin og Min-Xia Wu ved Public Technology Service Center, Fujian Medical University for deres tekniske assistanse. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin og Qi Ke ved Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtte. Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82001608 og 82101678), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (tilskuddsnummer 2019J05071), Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, Fujian-provinsen, Kina (tilskuddsnummer 2021Y9160), og Fujian Medical University høyt nivå talenter vitenskapelig forskning oppstartsfinansieringsprosjekt (tilskuddsnummer XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. 암 연구학. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Keywords: CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint
check_url/kr/65476?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image