JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Generering av centromerassocierade protein-E CENP-E-/- Knockout-cellinjer med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Denna artikel rapporterar konstruktionen av centromer-associerade protein-E (CENP-E) knockout-celler med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet och tre fenotypbaserade screeningstrategier. Vi har använt CENP-E knockout-cellinjen för att etablera ett nytt tillvägagångssätt för att validera CENP-E-hämmarnas specificitet och toxicitet, vilket är användbart för läkemedelsutveckling och biologisk forskning.

Abstract

CRISPR-systemet (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för exakt och effektiv genredigering i en mängd olika organismer. Centromerassocierat protein-E (CENP-E) är ett kinesin som är riktat mot plusändarna och som krävs för kinetokor-mikrotubulifångst, kromosomjustering och kontrollpunkt för spindelmontering. Även om cellulära funktioner hos CENP-E-proteinerna har studerats väl, har det varit svårt att studera de direkta funktionerna hos CENP-E-proteiner med traditionella protokoll eftersom CENP-E-ablation vanligtvis leder till aktivering av kontrollpunkter för spindelmontering, cellcykelstopp och celldöd. I den här studien har vi helt slagit ut CENP-E-genen i humana HeLa-celler och framgångsrikt genererat CENP-E-/- HeLa-cellerna med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet.

Tre optimerade fenotypbaserade screeningstrategier fastställdes, inklusive screening av cellkolonier, fenotyper av kromosomanpassning och de fluorescerande intensiteterna hos CENP-E-proteiner, vilket effektivt förbättrar screeningeffektiviteten och den experimentella framgångsfrekvensen för CENP-E-knockoutcellerna . Det är viktigt att notera att CENP-E-deletion resulterar i kromosomfelställning, den onormala placeringen av BUB1-mitotiska kontrollpunktsserin/treoninkinas B-proteiner (BubR1) och mitotiska defekter. Dessutom har vi använt CENP-E knockout HeLa-cellmodellen för att utveckla en identifieringsmetod för CENP-E-specifika hämmare.

I denna studie har ett användbart tillvägagångssätt för att validera specificiteten och toxiciteten hos CENP-E-hämmare fastställts. Dessutom presenterar denna artikel protokollen för CENP-E-genredigering med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet, vilket kan vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismerna för CENP-E i celldelning. Dessutom skulle CENP-E knockout-cellinjen bidra till upptäckten och valideringen av CENP-E-hämmare, som har viktiga implikationer för utveckling av antitumörläkemedel, studier av celldelningsmekanismer inom cellbiologi och kliniska tillämpningar.

Introduction

Konstruerad genomredigering förmedlar de riktade modifieringarna av gener i en mängd olika celler och organismer. I eukaryoter kan platsspecifik mutagenes introduceras genom applicering av sekvensspecifika nukleaser som stimulerar homolog rekombination av mål-DNA1. Under de senaste åren har flera genomredigeringstekniker, inklusive zinkfingernukleaser (ZFN)2,3, transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALENs)4,5 och målsökande meganukleaser 6,7, konstruerats för att klyva genom på specifika platser, men dessa metoder kräver komplex proteinteknik och redundanta experimentella procedurer. Studier har visat att typ II-systemet med prokaryota klustrade korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/Cas-systemet är en effektiv genredigeringsteknik, som specifikt förmedlar RNA-styrd, platsspecifik DNA-klyvning i en mängd olika celler och arter 8,9,10,11. CRISPR/Cas9-genknockout-tekniken har revolutionerat områdena grundläggande biologi, bioteknik och medicin12.

Bakterier och de flesta arkéer har utvecklat ett RNA-baserat adaptivt immunsystem som använder CRISPR- och Cas-proteiner för att identifiera och förstöra virus ochplasmider. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-endonukleas innehåller den RuvC-liknande Holliday-korsningsresolvasen (RuvC) och His-Asn-His (HNH)-domänen, som effektivt kan förmedla sekvensspecifika, dubbelsträngade brott (DSB) genom att tillhandahålla ett syntetiskt enkelguide-RNA (sgRNA) som innehåller CRISPR-RNA (crRNA) och transaktiverande crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB kan repareras genom den indelbildande icke-homologa ändsammanfogningsvägen (NHEJ) eller homologiriktad reparation (HDR), som introducerar flera mutationer, inklusive insättningar, deletioner eller ärrfria enkelnukleotidsubstitutioner, i däggdjursceller 1,8. Både den felbenägna NHEJ och den högupplösta HDR-vägen kan användas för att förmedla genknockout genom insättningar eller deletioner, vilket kan orsaka frameshift-mutationer och för tidiga stoppkodon10.

Kinesin-7 CENP-E krävs för kinetokor-mikrotubulibindning och kromosominriktning under celldelning 17,18,19. Antikroppsmikroinjektion 20,21, siRNA-utarmning22,23, kemisk hämning 24,25,26 och genetisk deletion 27,28,29 av CENP-E leder till kromosomfelställning, aktivering av spindelenhetens kontrollpunkt och mitotiska defekter, vilket resulterar i aneuploidi och kromosomal instabilitet 19,30. Hos möss leder CENP-E-deletion till onormal utveckling och embryonal dödlighet i de mycket tidiga utvecklingsstadierna 27,29,31. Genetisk deletion av CENP-E leder vanligtvis till kromosomfelställning och celldöd 26,27,29, vilket är ett hinder för att studera CENP-E-proteinernas funktioner och mekanismer.

En nyligen genomförd studie har fastställt en villkorad CENP-E-knockout-cellinje med hjälp av en Auxin-inducerbar CRISPR/Cas9-genredigeringsmetod32, vilket möjliggör snabb nedbrytning av CENP-E-proteiner på relativt kort tid33. Hittills har dock inga stabila CENP-E-knockout-cellinjer fastställts, vilket är en olöst teknisk utmaning inom CENP-E-biologin. Med tanke på genetisk robusthet34, genetiska kompensationssvar 35,36,37 och komplexa intracellulära miljöer, eftersom de direkta konsekvenserna av fullständig radering av CENP-E kan vara komplexa och oförutsägbara, är det viktigt att etablera CENP-E knockout-cellinjer för undersökning av mekanismer för kromosomanpassning, kontrollpunkt för spindelmontering och signalvägar nedströms.

Upptäckten och tillämpningarna av CENP-E-hämmare är viktiga för cancerbehandling. Hittills har sju typer av CENP-E-hämmare hittats och syntetiserats, inklusive GSK923295 och dess derivat24,25, PF-2771 38,39, imidazo[1,2-a]pyridinbyggnadsderivat40,41, förening-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 och bens[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolderivat47. Bland dessa hämmare är GSK923295 en allosterisk och effektiv CENP-E-hämmare som binder till den motoriska domänen av CENP-E och hämmar CENP-E mikrotubulistimulerad ATPas-aktivitet med en Ki på 3,2 ± 0,2 nM24,25. Jämfört med de hämmande effekterna av GSK923295 på odlade cancerceller är dock de terapeutiska effekterna av GSK923295 hos kliniska cancerpatienterinte idealiska GSK923295. Dessutom är specificiteten och biverkningarna av andra CENP-E-hämmare på CENP-E-proteinerna nyckelfrågor inom cancerforskningen.

I den här studien har vi helt slagit ut CENP-E-genen i HeLa-celler med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet. Tre optimerade fenotypbaserade screeningstrategier har etablerats, inklusive screening av cellkolonier, fenotyper av kromosomanpassning och de fluorescerande intensiteterna hos CENP-E-proteiner, för att förbättra screeningeffektiviteten och framgångsgraden för CENP-E-genredigering. Dessutom kan CENP-E knockout-cellinjer användas för att testa specificiteten hos kandidatföreningar för CENP-E.

Protocol

1. Konstruktion av CRISPR/Cas9-genens knockoutvektorer Välj målgenomisk DNA-sekvens på den humana CENP-E-genen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) och designa sgRNA med hjälp av ett online CRISPR-designverktyg (http://crispor.tefor.net/). Mata in en enda genomsekvens, välj genomet för “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148” och välj det intilliggande protospacermotivet “20 bp-NGG-spCas9”. Vä…

Representative Results

CENP-E-/- HeLa-cellerna genererades framgångsrikt med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet (figur 1). Tidslinjen och de kritiska experimentella stegen för denna metod visas i figur 1. Först designade och syntetiserade vi de CENP-E-specifika sgRNA:erna, glödgade och ligerade sgRNA:erna till pX458-plasmiden, transfekterade plasmiden till HeLa-celler och odlade dem i 48 timmar. De transfekterade cellerna dissocierades och såddes i en 96-…

Discussion

Kinesin-7 CENP-E är en nyckelregulator i kromosomjustering och spindelmontering checkpoint under celldelning 17,19,20. Genetisk deletion av CENP-E resulterar vanligtvis i aktivering av spindelenhetens kontrollpunkt, cellcykelstopp och celldöd 27,29,51,52. Således är konstruktionen av stabila CE…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar alla medlemmar i Cytoskeleton Laboratory vid Fujian Medical University för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin och Min-Xia Wu på Public Technology Service Center, Fujian Medical University för deras tekniska hjälp. Vi tackar Si-Yi Zheng, Ying Lin och Qi Ke vid Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences vid Fujian Medical University för deras stöd. Denna studie stöddes av följande bidrag: National Natural Science Foundation of China (anslagsnummer 82001608 och 82101678), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2019J05071), Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2021Y9160) och Fujian Medical University high-level talents science research-start-up funding-projekt (bidragsnummer XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. 암 연구학. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image