Denna artikel rapporterar konstruktionen av centromer-associerade protein-E (CENP-E) knockout-celler med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet och tre fenotypbaserade screeningstrategier. Vi har använt CENP-E knockout-cellinjen för att etablera ett nytt tillvägagångssätt för att validera CENP-E-hämmarnas specificitet och toxicitet, vilket är användbart för läkemedelsutveckling och biologisk forskning.
CRISPR-systemet (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-systemet har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för exakt och effektiv genredigering i en mängd olika organismer. Centromerassocierat protein-E (CENP-E) är ett kinesin som är riktat mot plusändarna och som krävs för kinetokor-mikrotubulifångst, kromosomjustering och kontrollpunkt för spindelmontering. Även om cellulära funktioner hos CENP-E-proteinerna har studerats väl, har det varit svårt att studera de direkta funktionerna hos CENP-E-proteiner med traditionella protokoll eftersom CENP-E-ablation vanligtvis leder till aktivering av kontrollpunkter för spindelmontering, cellcykelstopp och celldöd. I den här studien har vi helt slagit ut CENP-E-genen i humana HeLa-celler och framgångsrikt genererat CENP-E-/- HeLa-cellerna med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet.
Tre optimerade fenotypbaserade screeningstrategier fastställdes, inklusive screening av cellkolonier, fenotyper av kromosomanpassning och de fluorescerande intensiteterna hos CENP-E-proteiner, vilket effektivt förbättrar screeningeffektiviteten och den experimentella framgångsfrekvensen för CENP-E-knockoutcellerna . Det är viktigt att notera att CENP-E-deletion resulterar i kromosomfelställning, den onormala placeringen av BUB1-mitotiska kontrollpunktsserin/treoninkinas B-proteiner (BubR1) och mitotiska defekter. Dessutom har vi använt CENP-E knockout HeLa-cellmodellen för att utveckla en identifieringsmetod för CENP-E-specifika hämmare.
I denna studie har ett användbart tillvägagångssätt för att validera specificiteten och toxiciteten hos CENP-E-hämmare fastställts. Dessutom presenterar denna artikel protokollen för CENP-E-genredigering med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet, vilket kan vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka mekanismerna för CENP-E i celldelning. Dessutom skulle CENP-E knockout-cellinjen bidra till upptäckten och valideringen av CENP-E-hämmare, som har viktiga implikationer för utveckling av antitumörläkemedel, studier av celldelningsmekanismer inom cellbiologi och kliniska tillämpningar.
Konstruerad genomredigering förmedlar de riktade modifieringarna av gener i en mängd olika celler och organismer. I eukaryoter kan platsspecifik mutagenes introduceras genom applicering av sekvensspecifika nukleaser som stimulerar homolog rekombination av mål-DNA1. Under de senaste åren har flera genomredigeringstekniker, inklusive zinkfingernukleaser (ZFN)2,3, transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALENs)4,5 och målsökande meganukleaser 6,7, konstruerats för att klyva genom på specifika platser, men dessa metoder kräver komplex proteinteknik och redundanta experimentella procedurer. Studier har visat att typ II-systemet med prokaryota klustrade korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/Cas-systemet är en effektiv genredigeringsteknik, som specifikt förmedlar RNA-styrd, platsspecifik DNA-klyvning i en mängd olika celler och arter 8,9,10,11. CRISPR/Cas9-genknockout-tekniken har revolutionerat områdena grundläggande biologi, bioteknik och medicin12.
Bakterier och de flesta arkéer har utvecklat ett RNA-baserat adaptivt immunsystem som använder CRISPR- och Cas-proteiner för att identifiera och förstöra virus ochplasmider. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)-endonukleas innehåller den RuvC-liknande Holliday-korsningsresolvasen (RuvC) och His-Asn-His (HNH)-domänen, som effektivt kan förmedla sekvensspecifika, dubbelsträngade brott (DSB) genom att tillhandahålla ett syntetiskt enkelguide-RNA (sgRNA) som innehåller CRISPR-RNA (crRNA) och transaktiverande crRNA (tracrRNA)14,15,16. DSB kan repareras genom den indelbildande icke-homologa ändsammanfogningsvägen (NHEJ) eller homologiriktad reparation (HDR), som introducerar flera mutationer, inklusive insättningar, deletioner eller ärrfria enkelnukleotidsubstitutioner, i däggdjursceller 1,8. Både den felbenägna NHEJ och den högupplösta HDR-vägen kan användas för att förmedla genknockout genom insättningar eller deletioner, vilket kan orsaka frameshift-mutationer och för tidiga stoppkodon10.
Kinesin-7 CENP-E krävs för kinetokor-mikrotubulibindning och kromosominriktning under celldelning 17,18,19. Antikroppsmikroinjektion 20,21, siRNA-utarmning22,23, kemisk hämning 24,25,26 och genetisk deletion 27,28,29 av CENP-E leder till kromosomfelställning, aktivering av spindelenhetens kontrollpunkt och mitotiska defekter, vilket resulterar i aneuploidi och kromosomal instabilitet 19,30. Hos möss leder CENP-E-deletion till onormal utveckling och embryonal dödlighet i de mycket tidiga utvecklingsstadierna 27,29,31. Genetisk deletion av CENP-E leder vanligtvis till kromosomfelställning och celldöd 26,27,29, vilket är ett hinder för att studera CENP-E-proteinernas funktioner och mekanismer.
En nyligen genomförd studie har fastställt en villkorad CENP-E-knockout-cellinje med hjälp av en Auxin-inducerbar CRISPR/Cas9-genredigeringsmetod32, vilket möjliggör snabb nedbrytning av CENP-E-proteiner på relativt kort tid33. Hittills har dock inga stabila CENP-E-knockout-cellinjer fastställts, vilket är en olöst teknisk utmaning inom CENP-E-biologin. Med tanke på genetisk robusthet34, genetiska kompensationssvar 35,36,37 och komplexa intracellulära miljöer, eftersom de direkta konsekvenserna av fullständig radering av CENP-E kan vara komplexa och oförutsägbara, är det viktigt att etablera CENP-E knockout-cellinjer för undersökning av mekanismer för kromosomanpassning, kontrollpunkt för spindelmontering och signalvägar nedströms.
Upptäckten och tillämpningarna av CENP-E-hämmare är viktiga för cancerbehandling. Hittills har sju typer av CENP-E-hämmare hittats och syntetiserats, inklusive GSK923295 och dess derivat24,25, PF-2771 38,39, imidazo[1,2-a]pyridinbyggnadsderivat40,41, förening-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 och bens[d]pyrrolo[2,1-b]tiazolderivat47. Bland dessa hämmare är GSK923295 en allosterisk och effektiv CENP-E-hämmare som binder till den motoriska domänen av CENP-E och hämmar CENP-E mikrotubulistimulerad ATPas-aktivitet med en Ki på 3,2 ± 0,2 nM24,25. Jämfört med de hämmande effekterna av GSK923295 på odlade cancerceller är dock de terapeutiska effekterna av GSK923295 hos kliniska cancerpatienterinte idealiska GSK923295. Dessutom är specificiteten och biverkningarna av andra CENP-E-hämmare på CENP-E-proteinerna nyckelfrågor inom cancerforskningen.
I den här studien har vi helt slagit ut CENP-E-genen i HeLa-celler med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet. Tre optimerade fenotypbaserade screeningstrategier har etablerats, inklusive screening av cellkolonier, fenotyper av kromosomanpassning och de fluorescerande intensiteterna hos CENP-E-proteiner, för att förbättra screeningeffektiviteten och framgångsgraden för CENP-E-genredigering. Dessutom kan CENP-E knockout-cellinjer användas för att testa specificiteten hos kandidatföreningar för CENP-E.
Kinesin-7 CENP-E är en nyckelregulator i kromosomjustering och spindelmontering checkpoint under celldelning 17,19,20. Genetisk deletion av CENP-E resulterar vanligtvis i aktivering av spindelenhetens kontrollpunkt, cellcykelstopp och celldöd 27,29,51,52. Således är konstruktionen av stabila CE…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Cytoskeleton Laboratory vid Fujian Medical University för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin och Min-Xia Wu på Public Technology Service Center, Fujian Medical University för deras tekniska hjälp. Vi tackar Si-Yi Zheng, Ying Lin och Qi Ke vid Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences vid Fujian Medical University för deras stöd. Denna studie stöddes av följande bidrag: National Natural Science Foundation of China (anslagsnummer 82001608 och 82101678), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2019J05071), Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2021Y9160) och Fujian Medical University high-level talents science research-start-up funding-projekt (bidragsnummer XRCZX2017025).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
24-well plate | Corning | 3524 | |
4S Gelred, 10,000x in water | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009164 | |
96-well plate | Corning | 3599 | |
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10000218 | Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution. |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 100092690 | |
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab254326 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution |
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution. |
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab133583 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Slowing down the quenching of fluorescent signals. |
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody | Abcam | ab7291 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical Reagent | 69003435 | |
BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay | Promega | G3580 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Colchicine | Sinopharm Chemical Reagent | 61001563 | |
Confocal scanning microscope | Leica | Leica TCS SP8 | |
Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
DH5α competent cells | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
DL2000 DNA marker | TaKaRa | 3427A | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plasmid mini kit ![]() |
Omega | D6950 | |
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
Gentian violet | Sinopharm Chemical Reagent | 71019944 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS. |
Giemsa staining solution | Sinopharm Chemical Reagent | 71020260 | |
GraphPad Prism version 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Statistical analysis. |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
Humidified incubator | Heal Force | HF90/HF240 | |
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Image processing and analysis. |
Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
LB agar powder | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
Lipo6000 transfection reagent | Beyotime | C0526 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS. |
Penicillin-streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
SanPrep column DNA gel extraction kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
SanPrep column plasmid mini-preps kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | |
T4 polynucleotide kinase | TaKaRa | 2021A | |
TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent | 30189328 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS. |