यह लेख CRISPR/Cas9 प्रणाली और तीन फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों का उपयोग करके सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन-ई (CENP-E) नॉकआउट कोशिकाओं के निर्माण की रिपोर्ट करता है। हमने CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए CENP-E नॉकआउट सेल लाइन का उपयोग किया है, जो दवा विकास और जैविक अनुसंधान के लिए उपयोगी है।
CRISPR (क्लस्टर्ड रेगुलरली इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट)/Cas9 सिस्टम विभिन्न जीवों में सटीक और कुशल जीन एडिटिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन-ई (सीएनपी-ई) एक प्लस-एंड-डायरेक्टेड किनेसिन है जो कीनेटोकोर-माइक्रोट्यूब्यूल कैप्चर, क्रोमोसोम अलाइनमेंट और स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट के लिए आवश्यक है। हालांकि सीईएनपी-ई प्रोटीन के सेलुलर कार्यों का अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, लेकिन पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके सीईएनपी-ई प्रोटीन के प्रत्यक्ष कार्यों का अध्ययन करना मुश्किल हो गया है क्योंकि सीईएनपी-ई पृथक्करण आमतौर पर स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट सक्रियण, सेल चक्र गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। इस अध्ययन में, हमने मानव HeLa कोशिकाओं में CENP-E जीन को पूरी तरह से खटखटाया है और CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके CENP-E-/- HeLa कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है।
सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग, गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप, और सीईएनपी-ई प्रोटीन की फ्लोरोसेंट तीव्रता सहित तीन अनुकूलित फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों की स्थापना की गई, जो प्रभावी रूप से स्क्रीनिंग दक्षता और सीईएनपी-ई नॉकआउट कोशिकाओं की प्रयोगात्मक सफलता दर में सुधार करती है। महत्वपूर्ण रूप से, CENP-E विलोपन के परिणामस्वरूप गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट, BUB1 माइटोटिक चेकपॉइंट सेरीन/थ्रेओनीन किनेज B (BubR1) प्रोटीन का असामान्य स्थान और माइटोटिक दोष होते हैं। इसके अलावा, हमने CENP-E- विशिष्ट अवरोधकों के लिए एक पहचान विधि विकसित करने के लिए CENP-E नॉकआउट HeLa सेल मॉडल का उपयोग किया है।
इस अध्ययन में, सीईएनपी-ई अवरोधकों की विशिष्टता और विषाक्तता को मान्य करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण स्थापित किया गया है। इसके अलावा, यह पत्र सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग करके सीईएनपी-ई जीन संपादन के प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो कोशिका विभाजन में सीईएनपी-ई के तंत्र की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। इसके अलावा, सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइन सीईएनपी-ई अवरोधकों की खोज और सत्यापन में योगदान देगी, जिसमें एंटीट्यूमर दवा विकास, सेल जीव विज्ञान में कोशिका विभाजन तंत्र के अध्ययन और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।
इंजीनियर जीनोम संपादन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और जीवों में जीन के लक्षित संशोधनों की मध्यस्थता करता है। यूकेरियोट्स में, साइट-विशिष्ट उत्परिवर्तन को अनुक्रम-विशिष्ट न्यूक्लियस के अनुप्रयोगों द्वारा पेश किया जा सकता है जो लक्ष्य डीएनए1 के समरूप पुनर्संयोजन को उत्तेजित करते हैं। हाल के वर्षों में, जस्ता उंगली nucleases (ZFNs) 2,3, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभावक nucleases (TALENs) 4,5, और होमिंग meganucleases 6,7 सहित कई जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों, विशिष्ट साइटों पर जीनोम क्लीव करने के लिए इंजीनियर किया गया है, लेकिन इन दृष्टिकोणों जटिल प्रोटीन इंजीनियरिंग और निरर्थक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. अध्ययनों से पता चला है कि प्रकार द्वितीय प्रोकैरियोटिक क्लस्टर नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (सीआरआईएसपीआर)/कैस प्रणाली एक कुशल जीन संपादन तकनीक है, जो विशेष रूप से कोशिकाओं और प्रजातियों 8,9,10,11की एक विस्तृत विविधता में आरएनए-निर्देशित, साइट विशिष्ट डीएनए दरार मध्यस्थता है. Cas9 जीन नॉकआउट तकनीक ने बुनियादी जीव विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा12 के क्षेत्र में क्रांति ला दी है।
बैक्टीरिया और अधिकांश आर्किया ने एक आरएनए-आधारित अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित की है जो वायरस और प्लास्मिड13 को पहचानने और नष्ट करने के लिए सीआरआईएसपीआर और कैस प्रोटीन का उपयोग करती है। स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस Cas9 (SpCas9) एंडोन्यूक्लिएज में RuvC जैसा हॉलिडे जंक्शन रिसॉल्वेज़ (RuvC) और हिज-असन-हिज़ (HNH) डोमेन होता है, जो सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरएनए) युक्त सिंथेटिक सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रदान करके अनुक्रम-विशिष्ट, डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) को कुशलतापूर्वक मध्यस्थ कर सकता है और ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआरएनए (tracrRNA)14,15,16. डीएसबी को इंडल-फॉर्मिंग गैर-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) या होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, जो स्तनधारी कोशिकाओं 1,8 में सम्मिलन, विलोपन, या निशान-कम एकल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन सहित कई उत्परिवर्तन का परिचय देता है। त्रुटि-प्रवण एनएचईजे और उच्च-निष्ठा एचडीआर मार्ग दोनों का उपयोग सम्मिलन या विलोपन के माध्यम से जीन नॉकआउट की मध्यस्थता के लिए किया जा सकता है, जो फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन और समय से पहले कोडन10 को रोक सकता है।
कोशिका विभाजन 17,18,19के दौरान कीनेटोकोर-सूक्ष्मनलिका लगाव और गुणसूत्र संरेखण के लिए किनेसिन-7 सीईएनपी-ई की आवश्यकता होती है। एंटीबॉडी माइक्रोइंजेक्शन20,21, एसआईआरएनए की कमी22,23, रासायनिक निषेध 24,25,26, और सीईएनपी-ई के आनुवंशिक विलोपन 27,28,29 गुणसूत्र मिसलिग्न्मेंट की ओर जाता है, स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट और माइटोटिक दोषों की सक्रियता, जिसके परिणामस्वरूप एन्यूप्लोइडी और क्रोमोसोमल अस्थिरता 19,30 होती है. चूहों में, सीईएनपी-ई विलोपन असामान्य विकास और विकास 27,29,31 के बहुत प्रारंभिक चरणों में भ्रूण घातकता में परिणाम. CENP-E के आनुवंशिक विलोपन आमतौर पर गुणसूत्र misalignment और कोशिका मृत्यु 26,27,29, कार्यों और CENP-ई प्रोटीन के तंत्र का अध्ययन करने में एक बाधा है की ओर जाता है.
एक हालिया अध्ययन ने एक ऑक्सिन-इंड्यूसिबल सीआरआईएसपीआर/कैस 9 जीन-संपादन विधि32 का उपयोग करके एक सशर्त सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइन स्थापित की है, जो अपेक्षाकृत कम समय33 में सीईएनपी-ई प्रोटीन के तेजी से क्षरण को सक्षम बनाता है। हालांकि, आज तक, स्थिर सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइनें स्थापित नहीं की गई हैं, जो सीईएनपी-ई जीव विज्ञान में एक अनसुलझी तकनीकी चुनौती है। आनुवंशिक मजबूती34, आनुवंशिक मुआवजा प्रतिक्रियाओं 35,36,37, और जटिल इंट्रासेल्युलर वातावरण को ध्यान में रखते हुए, सीईएनपी-ई के पूर्ण विलोपन के प्रत्यक्ष परिणाम जटिल और अप्रत्याशित हो सकते हैं, गुणसूत्र संरेखण, धुरी विधानसभा चौकी, और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों के तंत्र की जांच के लिए सीईएनपी-ई नॉकआउट सेल लाइनों को स्थापित करना महत्वपूर्ण है।
कैंसर के उपचार के लिए CENP-E अवरोधकों की खोज और अनुप्रयोग महत्वपूर्ण हैं। आज तक, सात प्रकार के CENP-E अवरोधक पाए गए हैं और संश्लेषित किए गए हैं, जिनमें GSK923295 और इसके डेरिवेटिव24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a] पाइरीडिन मचान डेरिवेटिव40,41, यौगिक-A42,43, सिंटेलिन 44,45, UA6278446, और बेंजो [d] pyrrolo[2,1-b] थियाज़ोल डेरिवेटिव47 शामिल हैं. इन अवरोधकों में, GSK923295 एक एलोस्टेरिक और कुशल CENP-E अवरोधक है जो CENP-E के मोटर डोमेन से बांधता है और CENP-E सूक्ष्मनलिका-उत्तेजित ATPase गतिविधि को 3.2 ± 0.2 nM24,25 के Ki के साथ रोकता है। हालांकि, सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं पर GSK923295 के निरोधात्मक प्रभावों की तुलना में, नैदानिक कैंसर रोगियों में GSK923295 के चिकित्सीय प्रभाव आदर्श48,49 नहीं हैं, जिसने सीईएनपी-ई के लिए GSK923295 की विशिष्टता के बारे में भी चिंता जताई। इसके अलावा, CENP-E प्रोटीन पर अन्य CENP-E अवरोधकों की विशिष्टता और दुष्प्रभाव कैंसर अनुसंधान में महत्वपूर्ण मुद्दे हैं।
इस अध्ययन में, हमने CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करके HeLa कोशिकाओं में CENP-E जीन को पूरी तरह से खटखटाया है। सीईएनपी-ई जीन संपादन की स्क्रीनिंग दक्षता और सफलता दर में सुधार के लिए सेल कॉलोनी स्क्रीनिंग, गुणसूत्र संरेखण फेनोटाइप, और सीईएनपी-ई प्रोटीन की फ्लोरोसेंट तीव्रता सहित तीन अनुकूलित फेनोटाइप-आधारित स्क्रीनिंग रणनीतियों की स्थापना की गई है। इसके अलावा, CENP-E नॉकआउट सेल लाइनों CENP-E के लिए उम्मीदवार यौगिकों की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
किन्सिन-7 सीईएनपी-ई कोशिका विभाजन 17,19,20के दौरान गुणसूत्र संरेखण और धुरी विधानसभा चौकी में एक प्रमुख नियामक है। सीईएनपी-ई के आनुवंशिक विलोपन आमतौर पर धुरी विधानसभा चौ?…
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी चर्चाओं के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में साइटोस्केलेटन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम जून-जिन लिन, झी-होंग हुआंग, लिंग लिन, ली-ली पांग, लिन-यिंग झोउ, शी लिन, और मिन-ज़िया वू को सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम उनके समर्थन के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में बेसिक मेडिकल साइंसेज के प्रायोगिक शिक्षण केंद्र में सी-यी झेंग, यिंग लिन और क्यूई के को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82001608 और 82101678), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019J05071), विज्ञान और प्रौद्योगिकी के नवाचार के लिए संयुक्त निधि, फ़ुज़ियान प्रांत, चीन (अनुदान संख्या 2021Y9160), और फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी उच्च-स्तरीय प्रतिभा वैज्ञानिक अनुसंधान स्टार्ट-अप फंडिंग प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या XRCZX2017025)।
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
24-well plate | Corning | 3524 | |
4S Gelred, 10,000x in water | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009164 | |
96-well plate | Corning | 3599 | |
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10000218 | Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution. |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 100092690 | |
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab254326 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution |
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution. |
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab133583 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Slowing down the quenching of fluorescent signals. |
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody | Abcam | ab7291 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical Reagent | 69003435 | |
BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay | Promega | G3580 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Colchicine | Sinopharm Chemical Reagent | 61001563 | |
Confocal scanning microscope | Leica | Leica TCS SP8 | |
Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
DH5α competent cells | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
DL2000 DNA marker | TaKaRa | 3427A | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plasmid mini kit | Omega | D6950 | |
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
Gentian violet | Sinopharm Chemical Reagent | 71019944 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS. |
Giemsa staining solution | Sinopharm Chemical Reagent | 71020260 | |
GraphPad Prism version 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Statistical analysis. |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
Humidified incubator | Heal Force | HF90/HF240 | |
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Image processing and analysis. |
Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
LB agar powder | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
Lipo6000 transfection reagent | Beyotime | C0526 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS. |
Penicillin-streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
SanPrep column DNA gel extraction kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
SanPrep column plasmid mini-preps kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | |
T4 polynucleotide kinase | TaKaRa | 2021A | |
TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent | 30189328 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS. |