Denne protokol beskriver en kryoskademodel for at fremkalde dyb skade på flere kaudale myomerer hos voksne zebrafisk. Denne metode giver en ny tilgang til undersøgelse af skeletmuskulatur regenerering efter alvorligt tab af væv hos ikke-pattedyr hvirveldyr.
Skeletmuskulatur gennemgår fornyelse og restaurering efter mindre skade gennem aktivering af satellitlignende stamceller. Alvorlige skader på muskulaturen fører ofte til fibrose hos mennesker. Sammenlignet med pattedyr har zebrafisk en højere medfødt kapacitet til organregenerering, hvilket giver en stærk model til at studere vævsgendannelse efter omfattende skader på organet. Her beskrives en kryoskademodel for at fremkalde dyb skade på fire myomerer af den kaudale peduncle hos voksne zebrafisk. En specialfremstillet kryosonde blev designet til at passe til kropsformen og reproducerbart skade den laterale muskulatur fra huden til midterlinjen. Det er vigtigt, at kroppens integritet forblev intakt, og fiskene fortsatte deres svømmeaktivitet. Ændringer i skeletmuskulaturen blev vurderet ved histologisk farvning og fluorescensfarvning af sarkomeriske proteiner på vævssektioner. Denne metode vil åbne nye forskningsveje, der sigter mod at forstå, hvordan degenerationen af skeletmuskulaturen inducerer reparative reaktioner og dermed reaktivering af det myogene program hos voksne zebrafisk.
Hos hvirveldyr gennemgår beskadigede dele af forskellige væv homeostatisk fornyelse og restaurering i løbet af levetiden. Denne evne til fornyelse og genopretning afhænger typisk af tilstedeværelsen af kompetente stamceller eller de modne cellers proliferative kapacitet 1,2. Skeletmuskulatur omfatter postmitotiske myofibre, som er forbundet med lokale stamceller, kaldet satellitceller 3,4,5,6. Således indeholder dette væv cellulære kilder til effektiv forsegling af områder med afbrudt kontinuitet eller til reparation af mindre sår. Imidlertid efterfølges større volumetriske tab i pattedyrs skeletmuskulatur ofte af ikke-regenerativ reparation, såsom fibrose7. Dyremodeller kan give ny indsigt i de biologiske mekanismer, der fremmer regenerering af omfattende beskadigede organer.
Zebrafisken er en veletableret modelorganisme med en høj regenerativ kapacitet. Voksne zebrafisk kan regenerere en amputeret del af deres halefinne eller den resekterede spids af hjerteventriklen 8,9,10,11. Derudover er der tidligere anvendt en kryoskademetode til at studere finne- og hjerteregenerering hos zebrafisk12,13,14,15. I tilfælde af indre organer har kryoskademetoden den fordel, at den inducerer celledød uden at forstyrre organintegriteten og dermed efterligner fysiologiske tilstande16,17. Vævsaffald opløses ved naturlig clearance under sårheling efterfulgt af de reparerende processer. Det er dog endnu ikke fastslået, om denne metode kan anvendes på skeletmuskulatur.
Hos fisk muliggør lateral muskulatur side-til-side bøjning af bagagerummet under svømning18. Skeletmusklerne er organiseret i metamere enheder, kaldet myomere, som adskilles af bindevæv 5,19. Zebrafisk kan regenerere deres muskler efter mindre vævsforstyrrelser, såsom dem, der er forårsaget af laserablation eller et stiksår 20,21,22,23,24, men om hele myomerer kan regenerere efter omfattende skade forbliver ukendt. Denne mangel på viden skyldes sandsynligvis manglen på en passende skadesmodel. Denne protokol etablerer en ny tilgang til at fremkalde omfattende skade på skeletmuskulaturen, der spænder over flere myomere. Den beskrevne kryoskademetode er baseret på hurtig frysning og optøning af myofibrene med et forkølet rustfrit stålinstrument. På trods af den omfattende skade blev fiskens trivsel ikke alvorligt svækket. Hele myomeres kunne genoprettes, og dermed giver dette arbejde et nyt modelsystem til undersøgelse af mekanismerne for muskulaturregenerering hos voksne zebrafisk.
Zebrafisken giver en anamniote hvirveldyrmodelorganisme til at studere mekanismerne for muskelregenerering. De fleste af de eksisterende skademetoder, såsom laserablation eller stiksår, resulterer i relativt mindre vævsforstyrrelse20,21,22,23. Større resektioner er blevet udført på ekstraokulær muskel26. Imidlertid ville denne kirurgiske tilgang sandsynligvis være mindre passende for lateral muskulatur på grund af sundhedsfarerne ved at skære kropsvæggen. For at undgå sådanne invasive procedurer beskriver denne protokol en mildere form for skade, der ikke desto mindre resulterer i dyb skade på den kaudale peduncle. Denne tilgang er afhængig af en overfladisk manipulation, der giver mulighed for meget præcis målretning af nogle få myomerer på den ene side af kroppen. Kryoskademodellens styrker ligger i dens reproducerbarhed og evne til at producere omfattende muskeldegeneration; Baseret på disse styrker giver denne model en ny vej til at studere, hvordan kroppen reagerer på betydeligt muskeltab.
Anvendelsen af ekstrem kulde fører til et termisk chok, som ødelægger plasmamembranen og organellerne i det berørte muskelvæv27. Som følge heraf gennemgår de skadede myofibre “utilsigtet” celledød28. Derfor kan det beskadigede væv resorberes af naturlige mekanismer for sårrensning. Zebrafisk tolererer kryoskadeproceduren godt, da overlevelsesraten i denne undersøgelse var næsten 100%, da den forkølede sonde var korrekt placeret på kroppen i den nøjagtige varighed. Men hvis såret er for omfattende (f.eks. hvis der påføres for meget tryk, eller varigheden af kryoskade er for lang), kan fisken vise afvigende svømmebevægelser kort efter proceduren, og dyret skal aflives som et humant endepunkt. For andre fiskearter bør eksponeringstiden for kryosonden justeres i henhold til kroppens størrelse.
Efter kryoskade kan fisken genoptage deres svømmeaktivitet uden symptomer på unormal bevægelse. Kryoskadede fisk svømmer dog mindre dynamisk end kontrolfisk, hvilket indikerer nogle milde svækkelser. Yderligere kvantificering af fiskens adfærd på forskellige tidspunkter efter kryoskade vil være nødvendig for at bestemme tidsmæssige ændringer i svømmepræstationen.
Virkningen af kryoskademetoden på andre ikke-muskelvæv i den kaudale peduncle mangler stadig at blive belyst. Det er klart, at det yderste kropslag (dvs. huden) er beskadiget af proceduren. I denne sammenhæng kan kryoskademetoden give en ny strategi til at studere sårheling, skalaregenerering og genoprettelse af pigmenteringsmønsteret. Desuden kan vaskulaturen og innerveringen af myomeres også påvirkes af kryoskade, og disse emner kræver yderligere undersøgelse.
Kryoskademodellen har tidligere været brugt til at undersøge zebrafiskens hjerteregenerering13,14,15,29. Denne metode viste nogle fordele sammenlignet med ventrikulær resektionsmetode10 på grund af den forbigående aflejring af et kollagenrigt ar, som bedre efterligner infarktets helingsrespons hos mennesker30. Bemærkelsesværdigt kan zebrafisk regenerere deres hjerte efter flere kryoskader31. Interessant nok er kryoskade også blevet anvendt på zebrafiskfinnen, hvilket resulterer i histolytiske processer12. I modsætning til den klassiske finneamputation indeholder den resterende kryoskadede stub en forvrænget margen med en blanding af dødt materiale og sunde celler. Undersøgelser med både zebrafiskens organer, hjertet og finnen, har afsløret zebrafiskens stærke evne til at genoprette deres oprindelige funktionelle komponenter, selv efter omfattende vævsskader. Hvorvidt den kryoskadede skeletmuskulatur aktiverer et samspil mellem reparative og regenerative processer, berettiger fremtidige undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker V. Zimmermann for fiskepleje samt Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli og Lea Gigon for igangsættelsen af dette projekt og deres foreløbige resultater. Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation, bevillingsnummer 310030_208170.
Program | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
Material/ Equipment | |||
35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Surgical scissors | Any | / | |
TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | |||
Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
Recipies/Solutions | |||
1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
2.7 mM KCl | Sigma | ||
10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
2 g Orange G | Sigma | ||
1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |