Denne protokollen beskriver en kryoskademodell for å indusere dyp skade på flere kaudale myomerer hos voksne sebrafisker. Denne metoden gir en ny tilnærming for å studere skjelettmuskulaturregenerering etter alvorlig tap av vev hos virveldyr som ikke er pattedyr.
Skjelettmuskulatur gjennomgår fornyelse og restaurering etter mindre skade gjennom aktivering av satellittlignende stamceller. Alvorlige skader i muskulaturen fører ofte til fibrose hos mennesker. Sammenlignet med pattedyr har sebrafisk en høyere medfødt kapasitet for organregenerering, noe som gir en kraftig modell for å studere vevsrestaurering etter omfattende skade på organet. Her beskrives en kryoskademodell for å indusere dyp skade på fire myomerer av kaudal peduncle hos voksne sebrafisker. En skreddersydd kryoprobe ble designet for å passe til kroppsformen og reproduserbart skade den laterale muskulaturen fra huden til midtlinjen. Det er viktig at kroppsintegriteten forblir intakt, og fisken fortsatte sin svømmeaktivitet. Forandringer i skjelettmuskulaturen ble vurdert ved histologisk farging og fluorescensfarging av sarkomerproteiner på vevssnitt. Denne metoden vil åpne nye veier for forskning som tar sikte på å forstå hvordan degenerasjonen av skjelettmuskulaturen induserer reparative responser og dermed reaktivering av det myogene programmet hos voksne sebrafisker.
Hos vertebrater gjennomgår skadede deler av forskjellige vev homeostatisk fornyelse og restaurering i løpet av levetiden. Denne kapasiteten til fornyelse og restaurering avhenger vanligvis av tilstedeværelsen av kompetente stamceller eller den proliferative kapasiteten til de modne cellene 1,2. Skjelettmuskulatur består av postmitotiske myofibre, som er assosiert med lokale stamceller, kalt satellittceller 3,4,5,6. Dermed inneholder dette vevet cellulære kilder for effektiv forsegling av områder med avbrutt kontinuitet eller for reparasjon av mindre sår. Imidlertid blir større volumetriske tap i pattedyrs skjelettmuskulatur ofte fulgt av ikke-regenerativ reparasjon, som fibrose7. Dyremodeller kan gi ny innsikt i de biologiske mekanismene som fremmer regenerering av omfattende skadede organer.
Sebrafisken er en veletablert modellorganisme med høy regenerativ kapasitet. Voksen sebrafisk kan regenerere en amputert del av halefinnen eller resektert apex av hjerteventrikkelen 8,9,10,11. I tillegg har en kryoskademetode tidligere blitt brukt for å studere finne- og hjerteregenerering hos sebrafisk12,13,14,15. Når det gjelder indre organer, har kryoskademetoden fordelen av å indusere celledød uten å forstyrre organets integritet, og dermed etterligne fysiologiske forhold16,17. Vevsavfall oppløses ved naturlig clearance under sårheling, etterfulgt av reparative prosesser. Men om denne metoden kan brukes på skjelettmuskulatur gjenstår å bli etablert.
Hos fisk gjør sidemuskulaturen det mulig å bøye stammen fra side til side under svømming18. Skjelettmuskulaturen er organisert i metamere enheter, kalt myomerer, som er adskilt av bindevev 5,19. Sebrafisk kan regenerere muskelen etter mindre vevsforstyrrelser, for eksempel de som er forårsaket av laserablasjon eller et stikksår 20,21,22,23,24, men om hele myomerer kan regenerere etter omfattende skade er fortsatt ukjent. Dette kunnskapshullet skyldes trolig mangel på en egnet skademodell. Denne protokollen etablerer en ny tilnærming for å indusere omfattende skade på skjelettmuskulaturen, som spenner over flere myomerer. Den beskrevne kryoskademetoden er basert på rask frysing og tining av myofibrene med et forkjølt rustfritt stålinstrument. Til tross for de omfattende skadene ble ikke fiskens trivsel alvorlig svekket. Hele myomerer kan gjenopprettes, og dermed gir dette arbeidet et nytt modellsystem for å studere mekanismene for muskulaturregenerering hos voksne sebrafisker.
Sebrafisken gir en anamniote virveldyrmodellorganisme for å studere mekanismene for muskelregenerering. De fleste av de eksisterende skademetodene, som laserablasjon eller stikksår, resulterer i relativt små vevsforstyrrelser20,21,22,23. Det er utført større reseksjoner på ekstraokulær muskel26. Imidlertid vil denne kirurgiske tilnærmingen trolig være mindre hensiktsmessig for lateral muskulatur på grunn av helsefarene ved å kutte kroppsveggen. For å unngå slike invasive prosedyrer, beskriver denne protokollen en mildere form for skade som likevel resulterer i dyp skade på caudal peduncle. Denne tilnærmingen er avhengig av en overfladisk manipulasjon som muliggjør svært presis målretting av noen få myomerer på den ene siden av kroppen. Styrken til kryoskademodellen ligger i dens reproduserbarhet og evne til å produsere omfattende muskeldegenerasjon; Basert på disse styrkene gir denne modellen en ny vei for å studere hvordan kroppen reagerer på betydelig muskeltap.
Påføringen av ekstrem kulde fører til et termisk sjokk, som ødelegger plasmamembranen og organeller i det berørte muskelvevet27. Som et resultat gjennomgår de skadede myofibrene “utilsiktet” celledød28. Følgelig kan det skadede vevet resorberes av naturlige mekanismer for sårfjerning. Sebrafisk tolererer kryoskadeprosedyren godt, da overlevelsesraten i denne studien var nesten 100%, gitt at den forkjølte sonden var riktig plassert på kroppen for den nøyaktige varigheten. Men hvis såret er for omfattende (f.eks. hvis det påføres for mye trykk eller varigheten av kryoskaden er for lang), kan fisken vise avvikende svømmebevegelser kort tid etter inngrepet, og dyret bør avlives som et humant endepunkt. For andre fiskearter bør eksponeringstiden for kryoproben justeres i henhold til kroppens størrelse.
Etter kryoskade kan fisken gjenoppta svømmeaktiviteten uten symptomer på unormal bevegelse. Kryoskadet fisk svømmer imidlertid mindre dynamisk enn kontrollfisk, noe som indikerer noen milde svekkelser. Videre kvantifisering av fiskens atferd på ulike tidspunkter etter kryoskade vil være nødvendig for å bestemme tidsmessige endringer i svømmeprestasjonen.
Effekten av kryoskademetoden på andre ikke-muskelvev av kaudal peduncle gjenstår å bli belyst. Det er åpenbart at det ytterste kroppslaget (dvs. huden) er skadet av prosedyren. I denne sammenheng kan kryoskademetoden gi en ny strategi for å studere sårheling, skalaregenerering og restaurering av pigmenteringsmønsteret. Videre kan myomerenes vaskulatur og innervasjon også påvirkes av kryoskade, og disse temaene krever ytterligere undersøkelser.
Kryoskademodellen har tidligere blitt brukt til å undersøke sebrafiskhjerteregenerering13,14,15,29. Denne metoden viste noen fordeler sammenlignet med ventrikulær reseksjonsmetode10 på grunn av forbigående avsetning av et kollagenrikt arr, som bedre etterligner infarkthelingsresponsen hos mennesker30. Bemerkelsesverdig nok kan sebrafisk regenerere hjertet etter flere kryoskader31. Interessant nok har kryoskade også blitt brukt på sebrafiskfinnen, noe som resulterer i histolytiske prosesser12. I motsetning til den klassiske finneamputasjonen inneholder den gjenværende kryoskadede stubben en forvrengt margin med en blanding av dødt materiale og friske celler. Studier med både sebrafiskorganer, hjertet og finnen, har avslørt sebrafiskens kraftige evne til å gjenopprette sine opprinnelige funksjonelle komponenter selv etter omfattende vevskader. Hvorvidt den kryoskadde skjelettmuskulaturen aktiverer et samspill mellom reparative og regenerative prosesser, garanterer fremtidige studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker V. Zimmermann for fiskepleie, samt Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli og Lea Gigon for oppstarten av dette prosjektet og deres foreløpige resultater. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation, stipendnummer 310030_208170.
Program | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
Material/ Equipment | |||
35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Surgical scissors | Any | / | |
TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | |||
Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
Recipies/Solutions | |||
1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
2.7 mM KCl | Sigma | ||
10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
2 g Orange G | Sigma | ||
1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |