Detta protokoll beskriver en kryoskademodell för att inducera djup skada på flera kaudala myomerer hos vuxna zebrafiskar. Denna metod ger ett nytt tillvägagångssätt för att studera skelettmuskelregenerering efter allvarlig vävnadsförlust hos ryggradsdjur som inte är däggdjur.
Skelettmuskulaturen genomgår förnyelse och restaurering efter mindre skada genom aktivering av satellitliknande stamceller. Svåra skador på muskulaturen leder ofta till fibros hos människor. I jämförelse med däggdjur har zebrafisk en högre medfödd kapacitet för organregenerering, vilket ger en kraftfull modell för att studera vävnadsåterställning efter omfattande skador på organet. Här beskrivs en kryoskademodell för att inducera djup skada på fyra myomerer av den kaudala peduncle hos vuxna zebrafiskar. En skräddarsydd kryosond utformades för att passa kroppsformen och reproducerbart skada sidomuskulaturen från huden till mittlinjen. Viktigt var att kroppsintegriteten förblev intakt och fisken fortsatte sin simaktivitet. Förändringar i skelettmuskulaturen bedömdes genom histologisk färgning och fluorescensfärgning av sarkomeriska proteiner på vävnadssnitt. Denna metod kommer att öppna nya forskningsvägar som syftar till att förstå hur degenerationen av skelettmuskeln inducerar reparativa svar och därmed reaktiveringen av det myogena programmet hos vuxna zebrafiskar.
Hos ryggradsdjur genomgår skadade delar av olika vävnader homeostatisk förnyelse och restaurering under livslängden. Denna förmåga till förnyelse och återställande beror vanligtvis på närvaron av kompetenta stamceller eller de mogna cellernas proliferativa kapacitet 1,2. Skelettmuskulaturen består av postmitotiska myofibrer, som är associerade med lokala stamceller, kallade satellitceller 3,4,5,6. Således innehåller denna vävnad cellulära källor för effektiv tätning av områden med avbruten kontinuitet eller för reparation av mindre sår. Större volymetriska förluster i skelettmuskulaturen hos däggdjur följs emellertid ofta av icke-regenerativ reparation, såsom fibros7. Djurmodeller kan ge nya insikter om de biologiska mekanismer som främjar regenerering av kraftigt skadade organ.
Zebrafisken är en väletablerad modellorganism med hög regenerativ kapacitet. Vuxna zebrafiskar kan regenerera en amputerad del av deras stjärtfena eller den resekterade toppen av hjärtkammaren 8,9,10,11. Dessutom har en kryoskademetod tidigare tillämpats för att studera fen- och hjärtregenerering hos zebrafisk12,13,14,15. När det gäller inre organ har kryoskademetoden fördelen att inducera celldöd utan att störa organintegriteten, vilket efterliknar fysiologiska tillstånd16,17. Vävnadsskräp sönderdelas genom naturlig clearance under sårläkning, följt av de reparerande processerna. Huruvida denna metod kan tillämpas på skelettmuskulaturen återstår dock att fastställa.
Hos fisk möjliggör sidomuskulaturen böjning av bålen från sida till sida under simning18. Skelettmusklerna är organiserade i metamera enheter, kallade myomerer, som separeras av bindväv 5,19. Zebrafisk kan regenerera sin muskel efter mindre vävnadsstörningar, såsom de som orsakas av laserablation eller ett sticksår 20,21,22,23,24, men om hela myomerer kan regenerera efter omfattande skada är fortfarande okänt. Denna kunskapslucka beror troligen på att det saknas en lämplig skademodell. Detta protokoll etablerar ett nytt tillvägagångssätt för att inducera omfattande skador på skelettmuskeln, som spänner över flera myomerer. Den beskrivna kryoskademetoden är baserad på snabb frysning och upptining av myofibrerna med ett förkylt instrument av rostfritt stål. Trots de omfattande skadorna försämrades inte fiskens välbefinnande allvarligt. Hela myomerer kan återställas, och därmed ger detta arbete ett nytt modellsystem för att studera mekanismerna för muskulaturregenerering hos vuxna zebrafiskar.
Zebrafisken tillhandahåller en anamniote ryggradsdjur modellorganism för att studera mekanismerna för muskelregenerering. De flesta av de befintliga skademetoderna, såsom laserablation eller sticksår, resulterar i relativt små vävnadsstörningar20,21,22,23. Större resektioner har utförts på extraokulär muskel26. Detta kirurgiska tillvägagångssätt skulle dock förmodligen vara mindre lämpligt för lateral muskulatur på grund av hälsoriskerna med att skära kroppsväggen. För att undvika sådana invasiva procedurer beskriver detta protokoll en mildare form av skada som ändå resulterar i djup skada på den kaudala peduncle. Detta tillvägagångssätt bygger på en ytlig manipulation som möjliggör en mycket exakt inriktning av några myomerer på ena sidan av kroppen. Kryoskademodellens styrkor ligger i dess reproducerbarhet och förmåga att producera omfattande muskeldegeneration; Baserat på dessa styrkor ger denna modell en ny väg att studera hur kroppen reagerar på betydande muskelförlust.
Appliceringen av extrem kyla leder till en termisk chock, som förstör plasmamembranet och organellerna i den drabbade muskelvävnaden27. Som ett resultat genomgår de skadade myofibrerna “oavsiktlig” celldöd28. Följaktligen kan den skadade vävnaden resorberas genom naturliga mekanismer för sårclearance. Zebrafiskar tolererar kryoskadeproceduren väl, eftersom överlevnadsgraden i denna studie var nästan 100%, med tanke på att den förkylda sonden var korrekt placerad på kroppen under den exakta varaktigheten. Men om såret är för omfattande (t.ex. om för mycket tryck appliceras eller kryoskadans varaktighet är för lång) kan fisken uppvisa avvikande simrörelser strax efter proceduren, och djuret bör avlivas som en human slutpunkt. För andra fiskarter bör exponeringstiden för kryosonden justeras efter kroppens storlek.
Efter kryoskada kan fisken återuppta sin simaktivitet utan några symtom på onormal rörelse. Kryoskadade fiskar simmar dock mindre dynamiskt än kontrollfisk, vilket indikerar några milda funktionsnedsättningar. Ytterligare kvantifiering av fiskens beteende vid olika tidpunkter efter kryoskada kommer att vara nödvändig för att bestämma tidsmässiga förändringar i simprestandan.
Effekten av kryoskademetoden på andra icke-muskelvävnader i den kaudala pedunkeln återstår att klarlägga. Uppenbarligen skadas det yttre kroppsskiktet (dvs. huden) av proceduren. I detta sammanhang kan kryoskademetoden ge en ny strategi för att studera sårläkning, skalregenerering och återställande av pigmenteringsmönstret. Dessutom kan myomerernas vaskulatur och innervation också påverkas av kryoskada, och dessa ämnen kräver ytterligare undersökning.
Kryoskademodellen har tidigare använts för att undersöka zebrafiskhjärtregenerering13,14,15,29. Denna metod visade vissa fördelar jämfört med ventrikulär resektionsmetod10 på grund av den övergående avsättningen av ett kollagenrikt ärr, vilket bättre efterliknar infarktläkningssvaret hos människor30. Anmärkningsvärt kan zebrafisk regenerera sitt hjärta efter flera kryoskador31. Intressant nog har kryoskada också applicerats på zebrafiskfenan, vilket resulterar i histolytiska processer12. I motsats till den klassiska fenamputationen innehåller den återstående kryoskadade stubben en förvrängd marginal med en blandning av dött material och friska celler. Studier med både zebrafiskorgan, hjärtat och fenan, har avslöjat zebrafiskens kraftfulla förmåga att återställa sina ursprungliga funktionella komponenter även efter omfattande vävnadsskador. Huruvida den kryoskadade skelettmuskeln aktiverar ett samspel mellan reparativa och regenerativa processer motiverar framtida studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar V. Zimmermann för fiskvård, liksom Dr. Thomas Bise, Dr. Catherine Pfefferli och Lea Gigon för initieringen av detta projekt och deras preliminära resultat. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation, bidragsnummer 310030_208170.
Program | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
Photoshop Version 23.5.3 | Adobe | ||
Material/ Equipment | |||
35/10 mm Petri Dish | Greiner Bio-one | Item No.: 627102 | |
Camera | Sony | / | HDR-PJ410 |
Cryostat | Histcom | HRA C50 | |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
Macro 50 mm f/2.8 EX DG lens | Sigma | / | Discontinued lense |
Peel-A-Way Embedding Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 | |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Sponge | any | any | flat sponge, c.a. 7cm x 3 cm x 1 cm |
Stainless steel cryoprobe | Custom-made | / | specifics in the article |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Surgical scissors | Any | / | |
TCS SP2 | Leica | / | Discontinoued product |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 | |
Dyes and Antibodies | |||
Dapi | Sigma | 10236276001 | Concentration: 1/2000 |
Phalloidin-Atto-565 (F-actin) | Sigma | 94072 | Concentration: 1 / 500 |
Tropomyosin (TPM1) | DHSB | CH1 | Concentration: 1 / 50 |
Recipies/Solutions | |||
1x PBS | 123 mM NaCl | Sigma | |
2.7 mM KCl | Sigma | ||
10 mM Na2HPO4 | Sigma | ||
1.8 mM KH2PO4 | Sigma | ||
AFOG solution | 3 g Fuchsin | Fisher Scientific | |
2 g Orange G | Sigma | ||
1 g Anilin blue | Fulka AG | ||
200 ml acifidied distilled H2O (pH 1.1) |