Här beskrivs ett enkelt arbetsflöde för att skilja endotelceller från humana pluripotenta stamceller följt av ett detaljerat protokoll för deras mekaniska stimulering. Detta gör det möjligt att studera endotelcellernas utvecklingsmekanobiologi. Detta tillvägagångssätt är kompatibelt med nedströmsanalyser av levande celler som samlats in från odlingschipet efter mekanisk stimulering.
Hjärtat är det första organet som etableras funktionellt under utvecklingen, vilket sätter igång blodcirkulationen mycket tidigt i dräktigheten. Förutom att transportera syre och näringsämnen för att säkerställa fostrets tillväxt, kontrollerar fostrets cirkulation många avgörande utvecklingshändelser som äger rum i endotelskiktet genom mekaniska signaler. Biomekaniska signaler inducerar strukturella förändringar i blodkärlen, etablerar arteriovenös specifikation och styr utvecklingen av hematopoetiska stamceller. Otillgängligheten av de framväxande vävnaderna begränsar förståelsen av cirkulationens roll i människans tidiga utveckling; Därför är in vitro-modeller centrala verktyg för studier av kärlmekanobiologi. Denna artikel beskriver ett protokoll för att differentiera endotelceller från humant inducerade pluripotenta stamceller och deras efterföljande sådd i en fluidisk enhet för att studera deras svar på mekaniska signaler. Detta tillvägagångssätt möjliggör långsiktig odling av endotelceller under mekanisk stimulering följt av hämtning av endotelcellerna för fenotypisk och funktionell karakterisering. In vitro-modellen som etablerats här kommer att vara avgörande för att belysa de intracellulära molekylära mekanismer som transducerar signaleringen medierad av mekaniska signaler, som i slutändan orkestrerar kärlutveckling under människans fosterliv.
Under embryonal utveckling är hjärtat det första organet som etablerar funktionalitet1, med detekterbara sammandragningar från det tidigaste stadiet av endokardiell rörbildning2. Cirkulationen, tillsammans med de mekaniska signaler som förmedlas av blodflödet i kärlet, styr många viktiga aspekter av den tidiga utvecklingen. Före etablering av fostrets cirkulation är kärlen organiserad i en primär kapillär plexus; Vid hjärtfunktion omorganiseras denna plexus till venös och arteriell vaskulatur3. De mekaniska signalernas roll i arteriovenös specifikation återspeglas av pan-endoteluttrycket av arteriella och venösa markörer innan blodflödet initieras4.
Hemodynamiska krafter styr inte bara utvecklingen av själva kärlet utan spelar också en grundläggande roll i kontrollen av blodkroppsbildningen. Hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) uppstår från specialiserade endotelceller som kallas hemogent endotel 5,6,7,8, som finns i olika anatomiska regioner av embryona uteslutande i det tidiga utvecklingsstadiet. Modeller med hjärtbrist, tillsammans med in vitro-modeller, har visat att mekaniska signaler instruerar och ökar HSPC-produktionen från det hemogena endotelet 9,10,11,12,13,14.
Olika typer av flödesdynamik har visat sig differentiera cellcykeln15, som är kända för att vara viktiga i både hemogent endotel 16,17 och arteriell cellspecifikation18. Sammantaget är mekaniska signaler avgörande faktorer för cellens identitet och funktion under utvecklingen. Nya in vitro-vätskekomponenter gör det möjligt för oss att övervinna de begränsningar som är förknippade med att studera utvecklingsmekanobiologi under mänsklig blodutveckling in vivo.
Det övergripande målet med protokollet i detta manuskript är att beskriva, steg för steg, den experimentella pipelinen för att studera effekten av skjuvstress på humana endotelceller som härrör in vitro från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs). Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner om differentiering av hiPSCs till endotelceller och deras efterföljande sådd till fluidiska chips för stimuleringsprotokollet. Med hjälp av detta kan olika in vitro-härledda endotelceller testas för sin förmåga att känna av skjuvspänningen genom att analysera deras orientering som svar på flödet. Detta kommer att göra det möjligt för andra laboratorier att ta itu med frågor om responsen på skjuvspänning och dess funktionella konsekvenser på olika endotelcellsidentiteter.
Protokollet som vi beskriver här möjliggör generering av mekanokänsliga endotelceller från humana pluripotenta stamceller och studier av deras svar på mekanisk stimulering medierad av kontrollerad skjuvspänning. Detta protokoll är helt cytokinbaserat och helt kompatibelt med GMP-reagenser för potentiell översättning till produktion av celler för cellterapi.
Härledningen av hiPSCs ger forskarna en instrumentell modell för de tidiga stadierna av embryonal utveckling som möjliggör studier av processer som annars är svåra att studera in vivo24. Faktum är att mänskliga embryonala vävnader som är tillgängliga för forskning samlas in från embryon som saknar cirkulation, och detta kan ha en betydande inverkan på den molekylära signaturen som styrs av mekaniska signaler. Tillvägagångssättet som beskrivs här möjliggör live-avbildning och realtidsstudier av cellens respons på skjuvspänning. Kombinationen av hiPSCs med fluidik ger en studiemodell som övervinner den begränsade tillgängligheten och otillgängligheten av fostrets vävnader under utveckling när initieringen av cirkulationen omformar och kontrollerar etableringen av det kardiovaskulära systemet och blodsystemet 3,9,10,25.
En begränsning med protokollet är att endotelcellerna som härrör från detta protokoll kanske inte återspeglar de olika identiteterna hos olika endotelceller som finns i de utvecklande vävnaderna. För att övervinna denna begränsning kan en specifik kombination av cytokiner behövas under differentieringsprocessen som föregår den fluidiska stimuleringen för att erhålla den önskade identiteten eller vävnadsspecifik fenotyp26. Isoleringen av endotelundergrupper kan erhållas med hjälp av en mer förfinad immunfenotyp under isoleringssteget. Detta protokoll isolerar endotelceller endast baserat på uttrycket av CD34, vilket möjliggör kolonnisolering i stället för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Detta minskar celldöd och risken för kontaminering. Dessutom är detta protokoll speciellt utformat för att studera skjuvspänningens roll medierad av laminär strömning. Alternativa fluidiska metoder kommer att behöva användas för att studera effekten av andra mekaniska signaler, såsom sträckning eller kompression, eller andra typer av flöde såsom störd eller störd strömning.
Vi har tidigare visat att iPSC-härledda endotelceller efterliknar de heterogena arteriovenösa cellulära identiteterna27 liknande de som observerats i fostrets dorsala aorta28,29,30. Detta är särskilt viktigt i samband med kärlutveckling och cellulär specifikation, som är känd för att styras av blodcirkulationen. Studier i olika modeller visade att brist på cirkulation resulterar i förändrad arteriovenös specifikation11,14,31. Mekanismerna som kopplar samman mekaniska signaler med cellspecifikation är fortfarande okända och pipelinen som beskrivs här möjliggör förfinade funktionella studier som inte kunde testas in vivo.
Denna pipeline beskriver produktion och stimulering av endotelceller som härrör från hiPSCs med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluidiska kanaler, vilket undviker behovet av att gjuta enheterna som för de allmänt använda polydimetylsiloxanenheterna (PDMS)12. Dessutom gör användningen av PDMS-chips insamlingen av de stimulerade cellerna särskilt utmanande, medan cellerna med detta protokoll enkelt kan hämtas från kanalen. Detta förbättrar analyskraften avsevärt och möjliggör efterföljande analyser såsom proteomik- och transkriptomiska analyser, flödescytometri och funktionella analyser, som kan behöva ytterligare odling eller in vivo-analyser .
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Research Advanced Grant 2021 från European Hematology Association, Global Research Award 2021 från American Society of Hematology och Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansierad av Welcome Trust och University of Edinburgh. Vi tackar Fiona Rossi från Flow Cytometry Facility för stöd i flödescytometrianalysen. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens på alla manuskriptversioner som accepterats av författaren och som härrör från detta bidrag.
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |