Metoder til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogeler i makroskala
Summary
Her præsenterer vi to protokoller til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogelmatricer i makroskala uden behov for en ekstern væskefase.
Abstract
Syntetiske gennetværk giver en platform for forskere og ingeniører til at designe og bygge nye systemer med funktionalitet kodet på et genetisk niveau. Mens det dominerende paradigme for udbredelsen af gennetværk er inden for et cellulært chassis, kan syntetiske gennetværk også anvendes i cellefrie miljøer. Lovende anvendelser af cellefrie gennetværk inkluderer biosensorer, da disse enheder er blevet demonstreret mod biotiske (Ebola-, Zika- og SARS-CoV-2-vira) og abiotiske (tungmetaller, sulfider, pesticider og andre organiske forurenende stoffer) mål. Cellefrie systemer implementeres typisk i flydende form i en reaktionsbeholder. At være i stand til at integrere sådanne reaktioner i en fysisk matrix kan imidlertid lette deres bredere anvendelse i et bredere sæt miljøer. Til dette formål er der udviklet metoder til indlejring af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner i en række hydrogelmatricer. En af de vigtigste egenskaber ved hydrogeler, der bidrager til dette arbejde, er hydrogelmaterialernes højvandsrekonstitutionskapacitet. Derudover har hydrogeler fysiske og kemiske egenskaber, der er funktionelt gavnlige. Hydrogeler kan frysetørres til opbevaring og rehydreres til senere brug. To trinvise protokoller til inkludering og analyse af CFPS-reaktioner i hydrogeler præsenteres. For det første kan et CFPS-system inkorporeres i en hydrogel via rehydrering med et cellelysat. Systemet i hydrogelen kan derefter induceres eller udtrykkes konstitutivt for fuldstændig proteinekspression gennem hydrogelen. For det andet kan cellelysat indføres i en hydrogel ved polymerisationspunktet, og hele systemet kan frysetørres og rehydreres på et senere tidspunkt med en vandig opløsning indeholdende induceren til ekspressionssystemet kodet i hydrogelen. Disse metoder har potentialet til at muliggøre cellefrie gennetværk, der giver sensoriske evner til hydrogelmaterialer, med potentiale for udbredelse uden for laboratoriet.
Introduction
Syntetisk biologi integrerer forskellige tekniske discipliner til at designe og konstruere biologisk baserede dele, enheder og systemer, der kan udføre funktioner, der ikke findes i naturen. De fleste syntetiske biologiske tilgange er stadig bundet til levende celler. I modsætning hertil muliggør cellefrie syntetiske biologiske systemer hidtil usete niveauer af kontrol og frihed i design, hvilket muliggør øget fleksibilitet og en forkortet tid til konstruktion af biologiske systemer, samtidig med at mange af begrænsningerne ved traditionelle cellebaserede genekspressionsmetoder elimineres1,2,3. CFPS anvendes i et stigende antal applikationer på tværs af adskillige discipliner, herunder konstruktion af kunstige celler, prototypning af genetiske kredsløb, udvikling af biosensorer og produktion af metabolitter 4,5,6. CFPS har også været særlig nyttig til fremstilling af rekombinante proteiner, der ikke let kan udtrykkes i levende celler, såsom aggregeringstilbøjelige proteiner, transmembranproteiner og toksiske proteiner 6,7,8.
CFPS udføres typisk i flydende reaktioner. Dette kan dog begrænse deres anvendelse i nogle situationer, da enhver flydende cellefri enhed skal være indeholdt i en reaktionsbeholder. Begrundelsen for udviklingen af de metoder, der præsenteres her, var at tilvejebringe robuste protokoller til indlejring af cellefrie syntetiske biologiske enheder i hydrogeler, ikke som en proteinproduktionsplatform i sig selv, men i stedet for at tillade brugen af hydrogeler som et fysisk chassis til implementering af cellefrie enheder uden for laboratoriet. Brugen af hydrogeler som CFPS-chassis har flere fordele. Hydrogeler er polymere materialer, der på trods af et højt vandindhold (undertiden over 98%) har faste egenskaber 9,10,11. De har anvendelser som pastaer, smøremidler og klæbemidler og er til stede i produkter så forskellige som kontaktlinser, sårforbindinger, marine klæbebånd, jordforbedringsmidler og babybleer 9,11,12,13,14. Hydrogels er også under aktiv efterforskning som narkotikaleveringskøretøjer 9,15,16,17. Hydrogeler kan også være biokompatible, biologisk nedbrydelige og have nogle stimuliresponser af deres egne 9,18,19,20. Derfor er målet her at skabe synergi mellem molekylærbiologisk afledt funktionalitet og materialevidenskab. Til dette formål er der gjort en indsats for at integrere cellefri syntetisk biologi med en række materialer, herunder kollagen, laponit, polyacrylamid, fibrin, PEG-peptid og agarose 11,21,22 samt at belægge overflader af glas, papir og klud 11,23,24 med CFPS-enheder. De protokoller, der præsenteres her, demonstrerer to metoder til indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogelmatricer i makroskala (dvs. >1 mm) ved hjælp af agarose som eksempelmateriale. Agarose blev valgt på grund af dets høje vandabsorptionskapacitet, kontrollerede selvgeleringsegenskaber og justerbare mekaniske egenskaber 11,24,25,26. Agarose understøtter også funktionel CFPS, er billigere end mange andre hydrogelalternativer og er biologisk nedbrydelig, hvilket gør det til et attraktivt valg som et eksperimentelt modelsystem. Disse metoder er imidlertid tidligere blevet påvist som egnede til indlejring af CFPS i en række alternative hydrogeler11. I betragtning af den brede vifte af anvendelser af hydrogeler og funktionaliteten af CFPS kan de metoder, der demonstreres her, danne grundlag for, at forskere er i stand til at udvikle biologisk forbedrede hydrogelmaterialer, der passer til deres egne formål.
I tidligere undersøgelser er mikrogelsystemer med et størrelsesinterval fra 1 μm til 400 μm blevet anvendt til at udføre CFPS i hydrogeler nedsænket i reaktionsbuffer 23,27,28,29,30,31. Kravet om at nedsænke hydrogeler i CFPS-reaktionsbuffere begrænser imidlertid mulighederne for deres anvendelse som materialer i sig selv. De protokoller, der præsenteres her, tillader CFPS-reaktioner at forekomme i hydrogeler uden behov for at nedsænke gelerne i reaktionsbuffere. For det andet tillader brugen af makroskalageler (mellem 2 mm og 10 mm i størrelse) undersøgelsen af den fysiske interaktion mellem hydrogeler og cellefri genekspression. For eksempel er det med denne teknik muligt at studere, hvordan hydrogelmatrixen påvirker CFPS-reaktioner11, og hvordan CFPS-reaktioner kan påvirke hydrogelmatrixen31. Større størrelser af hydrogeler giver også mulighed for udvikling af nye, bioprogrammerbare materialer32. Endelig er der ved at indlejre CFPS-reaktioner i hydrogeler også en potentiel reduktion i behovet for plastreaktionsbeholdere. Til implementering af cellefrie sensorer har dette klare fordele i forhold til enheder, der er afhængige af plastvarer. Samlet set giver indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogeler flere fordele for implementeringen af cellefrie enheder uden for laboratoriet.
Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres her, er at tillade drift af CFPS-reaktioner inden for hydrogelmatricer. To forskellige metoder demonstreres til indlejring af cellefrie proteinproduktionsreaktioner i hydrogelmaterialer i makroskala (figur 1). I metode A introduceres CFPS-komponenter til frysetørrede agarosehydrogeler for at danne et aktivt system. I metode B blandes smeltet agarose med CFPS-reaktionskomponenter for at danne et komplet CFPS-hydrogelsystem, som derefter frysetørres og opbevares, indtil det er nødvendigt. Disse systemer kan rehydreres med en mængde vand eller buffer og analysand for at starte reaktionen.
Denne undersøgelse bruger Escherichia coli-cellelysatbaserede systemer. Disse er nogle af de mest populære eksperimentelle CFPS-systemer, da E. coli-cellelysatpræparat er enkelt, billigt og opnår høje proteinudbytter. Cellelysatet suppleres med de makromolekylære komponenter, der er nødvendige for at udføre transkription og translation, herunder ribosomer, tRNA’er, aminoacyl-tRNA-syntetaser og initiering, forlængelse og termineringsfaktorer. Specifikt demonstrerer dette papir produktionen af eGFP og mCherry i agarosehydrogeler ved hjælp af E. coli-cellelysater og overvåger udseendet af fluorescens ved hjælp af en pladelæser og konfokal mikroskopi. Repræsentative resultater for mikrotiterpladelæseren kan ses i Whitfield et al.31, og de underliggende data er offentligt tilgængelige 33. Endvidere bekræftes ekspressionen af fluorescerende proteiner gennem gelerne ved anvendelse af konfokalmikroskopi. De to protokoller, der er demonstreret i dette papir, giver mulighed for samling og opbevaring af CFPS-baserede genetiske enheder i materia med det endelige mål at skabe et passende fysisk miljø til distribution af cellefrie genkredsløb på en måde, der understøtter feltimplementering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skitseret her er to protokoller til inkorporering af E. coli-cellelysatbaserede CFPS-reaktioner i agarosehydrogeler . Disse metoder muliggør samtidig genekspression i hele materialet. Protokollen kan tilpasses til andre CFPS-systemer og er med succes blevet gennemført med kommercielt tilgængelige CFPS-sæt ud over de laboratoriefremstillede cellelysater, der er beskrevet her. Det er vigtigt, at protokollen tillader genekspression i fravær af en ekstern væskefase. Det betyder, at systemet er selvstændigt og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender i høj grad støtten fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) og BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) og Engineering and Physical Sciences Research Council – Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data til støtte for denne publikation er frit tilgængelige på: 10.25405/data.ncl.22232452. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens til enhver Author Accepted Manuscript version, der opstår.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. 생화학. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
