القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية الراكدة
Summary
يصف هذا البروتوكول تحضير اللقاح ، والقياس الكمي للغشاء الحيوي على ألواح العيار الدقيق باستخدام صبغة البنفسج البلوري ، والعدد القابل للتطبيق في الأغشية الحيوية ، وتصور الأغشية الحيوية للراكدة.
Abstract
تسبب الراكدة عدوى المستشفيات ويمكن أن يساهم تكوين الأغشية الحيوية في البقاء على الأسطح الجافة مثل بيئات المستشفيات. وبالتالي ، فإن القياس الكمي والأغشية الحيوية والتصور هما طريقتان مهمتان لتقييم إمكانات سلالات الراكدة للتسبب في عدوى المستشفيات. يمكن قياس الأغشية الحيوية المتكونة على سطح الصفيحة الدقيقة من حيث الحجم وأعداد الخلايا. يمكن قياس أحجام الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخها باستخدام البنفسج البلوري ، والغسيل ، وإزالة البقع باستخدام الإيثانول ، ثم قياس الصبغة القابلة للذوبان باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. لتحديد عدد الخلايا المضمنة في الأغشية الحيوية ، يتم التخلص من الأغشية الحيوية باستخدام كاشطات الخلايا ، ويتم حصادها في المياه المالحة ، وتحريكها بقوة في وجود حبات زجاجية ، وتنتشر على أجار Acinetobacter. بعد ذلك ، يتم تحضين الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24-42 ساعة. بعد الحضانة ، يتم تعداد المستعمرات الحمراء لتقدير عدد الخلايا في الأغشية الحيوية. يمكن أن تكون طريقة العد القابلة للتطبيق هذه مفيدة أيضا لحساب خلايا Acinetobacter في الأغشية الحيوية المختلطة الأنواع. يمكن تصور الأغشية الحيوية الراكدة باستخدام أصباغ الفلورسنت. يتم استخدام صفيحة مجهرية متاحة تجاريا مصممة للتحليل المجهري لتشكيل الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح السفلي بأصباغ SYTO9 و propidium iodide ، وغسلها ، ثم تصورها باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
Introduction
من المعروف أن الراكدة تسبب عدوى المستشفيات ، ويتم الإبلاغ عن عدواها البشرية ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية ، بشكل متزايد1. ينتشر على نطاق واسع في المستشفيات ومرافق الرعاية الصحية والبيئات المرتبطة بالغذاء2،3،4. يمكن أن يعيش لفترة طويلة في البيئات بما في ذلك أسطح المستشفيات مثل قضبان السرير وطاولات السرير وسطح أجهزة التهوية والأحواض4. قد يكون هذا الثبات على الأسطح البيئية أحد العوامل المهمة التي تساهم في عدوى المستشفيات من Acinetobacter4.
الأغشية الحيوية هي شكل من أشكال الحياة الميكروبية وهي عبارة عن مصفوفة ميكروبية تتكون من خلايا ميكروبية حية ومواد بوليمرية خارج الخلية (EPS) من الخلايا5. يتم تضمين الخلايا الميكروبية في المصفوفة وغالبا ما تكون شديدة المقاومة للضغوط البيئية مثل الحرارة والأملاح والجفاف والمضادات الحيوية والمطهرات وقوى القص 6,7.
يمكن أن تشكل الراكدة الأغشية الحيوية على الأسطح ، مما يشير إلى أنها قد تساهم في إطالة البقاء على الأسطح البيئية ، بما في ذلك أسطح المستشفيات ، وتعزيز المقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية 8,9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يرتبط تكوين الأغشية الحيوية للراكدة بشكل كبير بالنتائج السريرية البشرية8. لذلك ، يمكن أن تكون قابلية تكوين الأغشية الحيوية لسلالات Acinetobacter أحد المؤشرات في التنبؤ بالبقاء البيئي والعدوى البشرية 8,10.
يمكن قياس الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح وتصورها لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية. ولتحديد كمية الأغشية الحيوية المتصلة بالسطح، عادة ما تكون الأغشية الحيوية ملطخة بأصباغ ملطخة بالأغشية الحيوية مثل البنفسج البلوري، ويتم استخلاص الأصباغ في محلول وقياسها للكثافة البصرية11. يعد تصور الأغشية الحيوية نهجا جيدا آخر لتقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية11. يمكن أن تكون طريقة التصور المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) التي تستخدم الخصوصية باستخدام أصباغ الفلورسنت أكثر فائدة لتوصيف مورفولوجيا الأغشية الحيوية مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل SEM12،13.
يمكن عد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية لتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية11. يتم فصل الخلايا القابلة للحياة المضمنة في الأغشية الحيوية وتخفيفها ونشرها على ألواح الآجار وتحضينها وتعدادها. نظرا لأن العدد الأكبر من الخلايا من المحتمل أن يلبي الجرعة المعدية ، فإنه يمكن أن يوفر معلومات أكثر تفصيلا عن الأغشية الحيوية ، مثل إمكانات العدوى المرتبطة بعدد الخلايا13,14.
تقدم هذه المقالة بروتوكولات خطوة بخطوة من أجل (1) تحديد الأغشية الحيوية المرفقة بالسطح ، (2) حساب الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية ، و (3) تصور الأغشية الحيوية باستخدام CLSM من Acinetobacter. تصف البروتوكولات المقدمة طرق تقييم قابلية تكوين الأغشية الحيوية لعزلات الراكدة وأغشية الراكدة وتوصيف الأغشية الحيوية الخاصة بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم قياس تكوين الأغشية الحيوية لعزلات Acinetobacter بدرجات متفاوتة ، وتصورها ، وتم تقدير الخلايا القابلة للحياة في الأغشية الحيوية (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).
في هذا البروتوكول ، تم استخدام درجتي ح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الرئيسي (E0210702-03) التابع للمعهد الكوري لبحوث الأغذية (KFRI) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
