Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms
Summary
Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter veroorzaakt nosocomiale infecties en de vorming van biofilm kan bijdragen aan de overleving op droge oppervlakken zoals ziekenhuisomgevingen. Kwantificering en visualisatie van biofilm zijn dus belangrijke methoden om het potentieel van Acinetobacter-stammen om nosocomiale infecties te veroorzaken te beoordelen. De biofilms die zich op het oppervlak van de microplaat vormen, kunnen worden gekwantificeerd in termen van volume en celaantallen. Biofilmvolumes kunnen worden gekwantificeerd door te kleuren met kristalviolet, te wassen, te kleuren met ethanol en vervolgens de opgeloste kleurstof te meten met behulp van een microplaatlezer. Om het aantal cellen dat in de biofilms is ingebed te kwantificeren, worden de biofilms afgeschraapt met behulp van celschrapers, geoogst in de zoutoplossing, krachtig geroerd in aanwezigheid van glasparels en verspreid op Acinetobacter-agar. Vervolgens worden de platen gedurende 24-42 uur bij 30 °C geïncubeerd. Na incubatie worden de rode kolonies opgesomd om het aantal cellen in biofilms te schatten. Deze haalbare telmethode kan ook nuttig zijn voor het tellen van Acinetobacter-cellen in biofilms van gemengde soorten. Acinetobacter-biofilms kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Een in de handel verkrijgbare microplaat die is ontworpen voor microscopische analyse wordt gebruikt om biofilms te vormen. Vervolgens worden de aan de onderkant bevestigde biofilms gekleurd met SYTO9- en propidiumjodidekleurstoffen, gewassen en vervolgens gevisualiseerd met confocale laserscanmicroscopie.
Introduction
Van Acinetobacter is bekend dat het nosocomiale infecties veroorzaakt, en de menselijke infectie, vooral in zorginstellingen, wordt steeds vaker gemeld1. Het is wijdverbreid in ziekenhuizen, zorginstellingen en voedselgerelateerde omgevingen 2,3,4. Het kan gedurende een lange periode overleven in omgevingen zoals ziekenhuisoppervlakken zoals bedhekken, nachtkastjes, het oppervlak van ventilatoren en gootstenen4. Een dergelijke persistentie op omgevingsoppervlakken kan een van de belangrijke factoren zijn die bijdragen aan de nosocomiale infecties van Acinetobacter4.
Biofilm is een vorm van microbieel leven en is een microbiële matrix die bestaat uit levende microbiële cellen en extracellulaire polymere stoffen (EPS) uit de cellen5. De microbiële cellen zijn ingebed in de matrix en zijn vaak zeer goed bestand tegen omgevingsinvloeden zoals hitte, zouten, droogte, antibiotica, ontsmettingsmiddelen en schuifkrachten 6,7.
Acinetobacter kan biofilms vormen op oppervlakken, wat suggereert dat het kan bijdragen aan een verlengde overleving op omgevingsoppervlakken, inclusief ziekenhuisoppervlakken, en een verhoogde resistentie tegen antibioticabehandeling 8,9. Bovendien zou de biofilmvorming van Acinetobacter sterk geassocieerd kunnen zijn met klinische resultaten bij de mens. Daarom zou de vervormbaarheid van de biofilm van Acinetobacter-stammen een van de indicatoren kunnen zijn bij het voorspellen van de overleving van het milieu en menselijke infecties 8,10.
De aan het oppervlak bevestigde biofilms kunnen worden gekwantificeerd en gevisualiseerd om de vervormbaarheid van de biofilm te beoordelen. Om aan het oppervlak gehechte biofilms te kwantificeren, worden de biofilms normaal gesproken gekleurd door biofilmkleurende kleurstoffen zoals kristalviolet, en worden de kleurstoffen geëlueerd in oplossing en gemeten op optische dichtheid11. Visualisatie van biofilms is een andere goede benadering om de vormbaarheid van biofilm te beoordelen11. De confocale laserscanmicroscopie (CLSM) visualisatiemethode die gebruik maakt van specificiteit met behulp van fluorescerende kleurstoffen zou nuttiger kunnen zijn om de morfologie van biofilm te karakteriseren in vergelijking met andere technieken zoals SEM12,13.
De levensvatbare cellen in biofilms kunnen worden geteld om het aantal levensvatbare cellen in biofilms te schatten11. De levensvatbare cellen die in biofilms zijn ingebed, worden losgemaakt, verdund, verspreid op agarplaten, geïncubeerd en geïnventariseerd. Omdat het hogere aantal cellen waarschijnlijk aan de infectieuze dosis voldoet, kan het meer gedetailleerde informatie geven over biofilms, zoals infectiepotentialen geassocieerd met het aantal cellen13,14.
Dit artikel presenteert stap-voor-stap protocollen om (1) oppervlaktegebonden biofilms te kwantificeren, (2) levensvatbare cellen in de biofilms te tellen en (3) de biofilms te visualiseren met behulp van CLSM van Acinetobacter. De gepresenteerde protocollen beschrijven de methoden om de biofilmvormbaarheid van Acinetobacter-isolaten te beoordelen en hun biofilms te karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van het beschreven protocol werd de biofilmvorming van Acinetobacter-isolaten in verschillende mate gemeten, gevisualiseerd en werden de levensvatbare cellen in de biofilms geschat (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3).
In dit protocol werden twee verschillende temperaturen gebruikt, 30 °C voor de groei en 25 °C voor de biofilmvorming van Acinetobacter. 30 °C werd gebruikt omdat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het Main Research Program (E0210702-03) van het Korea Food Research Institute (KFRI), gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap en ICT.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
