Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Inokulums, die Quantifizierung des Biofilms auf Mikrotiterplatten mit kristallviolettem Farbstoff, die Lebensfähigkeit in Biofilmen und die Visualisierung von Biofilmen von Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter verursacht nosokomiale Infektionen und seine Biofilmbildung kann zum Überleben auf trockenen Oberflächen wie z.B. Krankenhausumgebungen beitragen. Daher sind Biofilmquantifizierung und -visualisierung wichtige Methoden, um das Potenzial von Acinetobacter-Stämmen zur Verursachung nosokomialer Infektionen zu bewerten. Die Biofilme, die sich auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte bilden, können in Bezug auf Volumen und Zellzahl quantifiziert werden. Biofilmvolumina können durch Färben mit Kristallviolett, Waschen, Entfärben mit Ethanol und anschließendes Messen des gelösten Farbstoffs mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert werden. Um die Anzahl der in die Biofilme eingebetteten Zellen zu quantifizieren, werden die Biofilme mit Hilfe von Zellschabern abgekratzt, in der Kochsalzlösung geerntet, in Gegenwart von Glasperlen kräftig gerührt und auf Acinetobacter-Agar verteilt. Anschließend werden die Platten bei 30 °C für 24-42 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die roten Kolonien gezählt, um die Anzahl der Zellen in Biofilmen abzuschätzen. Diese brauchbare Zählmethode kann auch für die Zählung von Acinetobacter-Zellen in Biofilmen mit gemischten Spezies nützlich sein. Acinetobacter-Biofilme können mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Eine kommerziell erhältliche Mikrotiterplatte, die für die mikroskopische Analyse entwickelt wurde, wird zur Bildung von Biofilmen verwendet. Anschließend werden die an der Unterseite befestigten Biofilme mit SYTO9- und Propidiumiodid-Farbstoffen gefärbt, gewaschen und dann mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert.
Introduction
Es ist bekannt, dass Acinetobacter nosokomiale Infektionen verursacht, und über seine Infektion beim Menschen, insbesondere in Gesundheitseinrichtungen, wird zunehmend berichtet1. Es ist in Krankenhäusern, Gesundheitseinrichtungen und lebensmittelnahen Umgebungen weit verbreitet 2,3,4. Es kann über einen langen Zeitraum in Umgebungen wie Krankenhausoberflächen wie Bettgittern, Nachttischen, der Oberfläche von Beatmungsgeräten und Waschbecken überleben4. Eine solche Persistenz auf Umweltoberflächen könnte einer der signifikanten Faktoren sein, die zu den nosokomialen Infektionen von Acinetobacter4 beitragen.
Biofilm ist eine Form des mikrobiellen Lebens und ist eine mikrobielle Matrix, die aus lebenden mikrobiellen Zellen und extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) aus den Zellen besteht5. Die mikrobiellen Zellen sind in die Matrix eingebettet und oft sehr widerstandsfähig gegen Umweltbelastungen wie Hitze, Salze, Trockenheit, Antibiotika, Desinfektionsmittel und Scherkräfte 6,7.
Acinetobacter kann Biofilme auf Oberflächen bilden, was darauf hindeutet, dass es zu einem verlängerten Überleben auf Umweltoberflächen, einschließlich Krankenhausoberflächen, und zu einer erhöhten Resistenz gegen Antibiotikabehandlung beitragen kann 8,9. Darüber hinaus könnte die Biofilmbildung von Acinetobacter in hohem Maße mit den klinischen Ergebnissen beim Menschen assoziiert sein8. Daher könnte die Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Stämmen einer der Indikatoren für die Vorhersage des Überlebens in der Umwelt und menschlicher Infektionen sein 8,10.
Die oberflächengebundenen Biofilme können quantifiziert und visualisiert werden, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen. Um oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, werden die Biofilme normalerweise mit Biofilm-Färbefarbstoffen wie Kristallviolett gefärbt, und die Farbstoffe werden in Lösung eluiert und auf optische Dichtegemessen 11. Die Visualisierung von Biofilmen ist ein weiterer guter Ansatz, um die Formbarkeit von Biofilmen zu beurteilen11. Die Visualisierungsmethode der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM), die Spezifität unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, könnte zur Charakterisierung der Biofilmmorphologie nützlicher sein als andere Techniken wie REM12,13.
Die lebensfähigen Zellen in Biofilmen können gezählt werden, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Biofilmen abzuschätzen11. Die lebensfähigen Zellen, die in Biofilme eingebettet sind, werden abgelöst, verdünnt, auf Agarplatten verteilt, inkubiert und gezählt. Da die höhere Anzahl von Zellen wahrscheinlich die infektiöse Dosis erfüllt, kann sie detailliertere Informationen über Biofilme liefern, wie z. B. Infektionspotenziale, die mit der Anzahl der Zellen assoziiert sind13,14.
In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Protokolle vorgestellt, um (1) oberflächengebundene Biofilme zu quantifizieren, (2) lebensfähige Zellen in den Biofilmen zu zählen und (3) die Biofilme mit CLSM von Acinetobacter zu visualisieren. Die vorgestellten Protokolle beschreiben die Methoden zur Beurteilung der Biofilmformbarkeit von Acinetobacter-Isolaten und zur Charakterisierung ihrer Biofilme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit Hilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Biofilmbildung von Acinetobacter-Isolaten in unterschiedlichem Ausmaß gemessen, visualisiert und die lebensfähigen Zellen in den Biofilmen geschätzt (Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3).
In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Temperaturen verwendet, 30 °C für das Wachstum und 25 °C für die Biofilmbildung von Acinetobacter</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Hauptforschungsprogramm (E0210702-03) des Korea Food Research Institute (KFRI) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT finanziert wird.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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