Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter
Summary
Questo protocollo descrive la preparazione dell’inoculo, la quantificazione del biofilm su piastre per microtitolazione utilizzando un colorante crystal violet, la conta vitale nei biofilm e la visualizzazione dei biofilm di Acinetobacter.
Abstract
L’Acinetobacter provoca infezioni nosocomiali e la sua formazione di biofilm può contribuire alla sopravvivenza su superfici asciutte come gli ambienti ospedalieri. Pertanto, la quantificazione e la visualizzazione del biofilm sono metodi importanti per valutare il potenziale dei ceppi di Acinetobacter di causare infezioni nosocomiali. I biofilm che si formano sulla superficie della micropiastra possono essere quantificati in termini di volume e numero di cellule. I volumi del biofilm possono essere quantificati mediante colorazione con crystal violet, lavaggio, decolorazione con etanolo, quindi misurazione del colorante solubilizzato con un lettore di micropiastre. Per quantificare il numero di cellule incorporate nei biofilm, i biofilm vengono raschiati utilizzando raschietti cellulari, raccolti nella soluzione salina, agitati vigorosamente in presenza di perle di vetro e sparsi su Acinetobacter agar. Successivamente, le piastre vengono incubate a 30 °C per 24-42 ore. Dopo l’incubazione, le colonie rosse vengono enumerate per stimare il numero di cellule nei biofilm. Questo metodo di conteggio può essere utile anche per contare le cellule di Acinetobacter nei biofilm di specie miste. I biofilm di Acinetobacter possono essere visualizzati utilizzando coloranti fluorescenti. Una micropiastra disponibile in commercio progettata per l’analisi microscopica viene impiegata per formare biofilm. Quindi, i biofilm attaccati alla superficie inferiore vengono colorati con SYTO9 e coloranti allo ioduro di propidio, lavati, quindi visualizzati con microscopia a scansione laser confocale.
Introduction
È noto che l’Acinetobacter causa infezioni nosocomiali e la sua infezione umana, soprattutto nelle strutture sanitarie, è sempre più segnalata1. È diffuso negli ospedali, nelle strutture sanitarie e negli ambienti associati al cibo 2,3,4. Può sopravvivere per un lungo periodo in ambienti come le superfici ospedaliere come le sponde dei letti, i comodini, la superficie dei ventilatori e i lavandini4. Tale persistenza sulle superfici ambientali può essere uno dei fattori significativi che contribuiscono alle infezioni nosocomiali di Acinetobacter4.
Il biofilm è una forma di vita microbica ed è una matrice microbica composta da cellule microbiche vive e sostanze polimeriche extracellulari (EPS) provenienti dalle cellule5. Le cellule microbiche sono incorporate nella matrice e sono spesso altamente resistenti agli stress ambientali come calore, sali, secchezza, antibiotici, disinfettanti e forze di taglio 6,7.
L’Acinetobacter può formare biofilm sulle superfici, suggerendo che può contribuire a prolungare la sopravvivenza sulle superfici ambientali, comprese le superfici ospedaliere, e a migliorare la resistenza al trattamento antibiotico 8,9. Inoltre, la formazione di biofilm di Acinetobacter potrebbe essere altamente associata agli esiti clinici nell’uomo8. Pertanto, la formabilità del biofilm dei ceppi di Acinetobacter potrebbe essere uno degli indicatori nel predire la sopravvivenza ambientale e le infezioni umane 8,10.
I biofilm attaccati alla superficie possono essere quantificati e visualizzati per valutare la formabilità del biofilm. Per quantificare i biofilm attaccati alla superficie, i biofilm vengono normalmente colorati con coloranti coloranti per biofilm come il crystal violet e i coloranti vengono eluiti in soluzione e misurati per la densità ottica11. La visualizzazione dei biofilm è un altro buon approccio per valutare la formabilità del biofilm11. Il metodo di visualizzazione della microscopia laser a scansione confocale (CLSM) che impiega la specificità utilizzando coloranti fluorescenti potrebbe essere più utile per caratterizzare la morfologia del biofilm rispetto ad altre tecniche come SEM12,13.
Le cellule vitali nei biofilm possono essere contate per stimare il numero di cellule vitali nei biofilm11. Le cellule vitali incorporate nei biofilm vengono staccate, diluite, distribuite su piastre di agar, incubate ed enumerate. Poiché è probabile che il numero maggiore di cellule soddisfi la dose infettiva, può fornire informazioni più dettagliate sui biofilm, come i potenziali di infezione associati al numero di cellule13,14.
Questo articolo presenta protocolli passo-passo per (1) quantificare i biofilm attaccati alla superficie, (2) contare le cellule vitali nei biofilm e (3) visualizzare i biofilm utilizzando il CLSM di Acinetobacter. I protocolli presentati descrivono i metodi per valutare la formabilità del biofilm degli isolati di Acinetobacter e caratterizzare i loro biofilm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il protocollo descritto, è stata misurata, visualizzata la formazione di biofilm di isolati di Acinetobacter con vari gradi e sono state stimate le cellule vitali nei biofilm (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
In questo protocollo sono state utilizzate due diverse temperature, 30 °C per la crescita e 25 °C per la formazione del biofilm di Acinetobacter. È stata utilizzata u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal Main Research Program (E0210702-03) del Korea Food Research Institute (KFRI), finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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