Identifisering av peptider av små ekstracellulære vesikler fra benmargsavledede makrofager
Summary
Denne protokollen beskriver en prosedyre for å isolere små ekstracellulære vesikler fra makrofager ved differensiell ultrasentrifugering og ekstrahere peptidomet for identifisering ved massespektrometri.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEVs) utskilles vanligvis ved eksocytose av multivesikulære legemer (MVB). Disse nanovesiklene med en diameter på <200 nm er tilstede i forskjellige kroppsvæsker. Disse sEV-ene regulerer ulike biologiske prosesser som gentranskripsjon og -translasjon, celleproliferasjon og overlevelse, immunitet og betennelse gjennom lasten, som proteiner, DNA, RNA og metabolitter. For tiden er det utviklet forskjellige teknikker for isolering av sEV. Blant dem regnes den ultrasentrifugeringsbaserte metoden som gullstandarden og er mye brukt for sEV-isolasjon. Peptidene er naturlig biomakromolekyler med mindre enn 50 aminosyrer i lengde. Disse peptidene deltar i en rekke biologiske prosesser med biologisk aktivitet, som hormoner, nevrotransmittere og cellevekstfaktorer. Peptidomet er ment å systematisk analysere endogene peptider i spesifikke biologiske prøver ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS). Her introduserte vi en protokoll for å isolere sEV ved differensiell ultrasentrifugering og ekstrahert peptidom for identifisering av LC-MS / MS. Denne metoden identifiserte hundrevis av sEVs-avledede peptider fra beinmargsavledede makrofager.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (sEV) med en diameter på mindre enn 200 nm er tilstede i nesten alle typer kroppsvæsker og utskilles av alle slags celler, inkludert urin, svette, tårer, cerebrospinalvæske og fostervann1. I utgangspunktet ble sEV ansett som beholdere for avhending av cellulært avfall, noe som førte til minimal forskning i det påfølgende tiåret2. Nylig indikerer økende bevis at sEVs inneholder spesifikke proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre metabolitter. Disse molekylene transporteres til målceller3, noe som bidrar til intercellulær kommunikasjon, hvorved de deltar i ulike biologiske prosesser, for eksempel vevsreparasjon, angiogenese, immunitet4 og betennelse5,6, tumorutvikling og metastase 7,8,9, etc.
For å lette studiet av sEV-er er det viktig å isolere sEV-er fra komplekse prøver. Ulike sEVs isolasjonsmetoder er utviklet basert på de fysiske og kjemiske egenskapene til sEV-er, for eksempel tetthet, partikkelstørrelse og overflatemarkørproteiner. Disse teknikkene inkluderer ultrasentrifugeringsbaserte metoder, partikkelstørrelsesbaserte metoder, immunoaffinitetsfangstbaserte metoder, sEVs utfellingsbaserte metoder og mikrofluidikkbaserte metoder10,11,12. Blant disse teknikkene er den ultrasentrifugeringsbaserte metoden anerkjent som gullstandarden for sEVs isolasjon og er den mest brukte teknikken13.
En økende mengde bevis tyder på tilstedeværelsen av en rekke uoppdagede biologisk aktive peptider i peptidomer av forskjellige organismer. Disse peptidene bidrar betydelig til mange fysiologiske prosesser ved å regulere vekst, utvikling, stressrespons 14,15 og signaltransduksjon16. Målet med sEVs peptidom er å avdekke peptidene som bæres av disse sEVene og gi ledetråder til deres biologiske funksjoner. Her presenterer vi en protokoll for å isolere sEV gjennom differensiell ultrasentrifugering, etterfulgt av ekstraksjon av peptider fra disse sEVene for videre analyse av deres peptidom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når man undersøker funksjonen til sEV-er, er det viktig å oppnå sEV-er med høy renhet fra komplekse biologiske prøver for å unngå potensielle forurensninger. Det er utviklet en rekke metoder for isolering av sEV13, og blant disse metodene har differensielle ultrasentrifugeringsbaserte metoder vist relativt høy renhet av sEV. I denne studien ble 200 ml cellesupernatant samlet i 6 timer, og ca. 200-300 μg sEV ble oppnådd ved differensiell ultrasentrifugering. Det skal imidlertid bemerkes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation of China (3157270). Vi takker Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) for å gi iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
