ביואנליזה של פיזור ראמאן משופרת ללא תוויות ללא תוויות המבוססת על ננו-גשושיות Au@Carbon נקודות
Summary
במחקר זה, פיתחנו ננו-פרובש טביעות אצבע מבוסס פיזור ראמאן (SERS) בעלות נמוכה עם תאימות ביולוגית חיובית כדי להראות הדמיה ביולוגית של תאים חיים ללא תוויות ולזהות שני זני חיידקים, ולהראות בפירוט כיצד להשיג ספקטרום SERS של תאים חיים בשיטה לא הרסנית.
Abstract
טכנולוגיית פיזור ראמאן משופרת פני השטח (SERS) משכה יותר ויותר תשומת לב בתחום הביו-רפואי בשל יכולתה לספק מידע מולקולרי על טביעות אצבע של דגימות ביולוגיות, כמו גם הפוטנציאל שלה באנליזה של תא יחיד. עבודה זו שואפת לבסס אסטרטגיה פשוטה לביואנליזה של SERS ללא תוויות המבוססת על ננו-גשושיות Au@carbon נקודות (Au@CDs). כאן, תקליטורים שמקורם בפוליפנולים משמשים כרדוקציה לסנתז במהירות ננו-מבנים Au@CD של מעטפת הליבה, מה שמאפשר ביצועי SERS רבי עוצמה גם כאשר ריכוז מתילן כחול (MB) נמוך עד 10-9 M, הודות למנגנון שיפור הרמאן השיתופי. עבור ביואנליזה, Au@CDs יכול לשמש כננו-חיישן SERS ייחודי לזיהוי המרכיבים התאיים של דגימות ביולוגיות (למשל, תאים סרטניים וחיידקים). ניתן להבדיל עוד יותר בין טביעות האצבע המולקולריות של מינים שונים לאחר שילוב עם ניתוח המרכיבים העיקריים. בנוסף, Au@CDs גם מאפשרים הדמיית SERS ללא תוויות כדי לנתח פרופילי הרכב תוך-תאיים. אסטרטגיה זו מציעה ביואנליזה אפשרית ונטולת תוויות של SERS, ופותחת אפשרות חדשה לננו-דיאגנוזה.
Introduction
אנליזה של תא בודד חיונית לחקר חשיפת ההטרוגניות התאית ולהערכת המצב המקיף של התא. התגובה המיידית של התא למיקרו-סביבה מצדיקה גם אנליזה של תא בודד1. עם זאת, ישנן כמה מגבלות לטכניקות הנוכחיות. זיהוי פלואורסצנטי יכול להיות מיושם על אנליזה של תא יחיד, אך הוא מוגבל על ידי רגישות נמוכה. אתגרים אחרים נובעים מהרקע הפלואורסצנטי המסובך של התאים וההלבנה הפלואורסצנטית תחת קרינה ארוכת טווח2. פיזור ראמאן משופר פני השטח (SERS) עשוי להתאים מבחינת אנליזה של תא בודד בשל יתרונותיו, כולל (1) שיקוף המידע המולקולרי הפנימי של טביעות האצבע והמצב המיידי, (2) רגישות פני שטח גבוהה במיוחד, (3) זיהוי מולטיפלקס נוח, (4) יציבות אור גבוהה, (5) ניתן לכמת זיהוי לצורך ניתוח השוואתי, (6) הימנעות מפלואורסצנטיות תאית עם עירור אורך גל NIR, (7) ניתן לבצע גילוי במימי תאי ניתן לכוון את הזיהוי לסביבה ו-(8) לאזור ספציפי בתוך התא 3,4,5.
ישנם שני מנגנונים מוכרים באופן נרחב להבנת SERS כתופעה בסיסית: שיפור אלקטרומגנטי (EM) כסיבה דומיננטית ושיפור כימי (CM). EM מתייחס, בתדירות נתונה של השדה המרגש, לתנודה של אלקטרונים קולקטיביים המונעים על ידי גלים אלקטרומגנטיים כאשר תדירות אור האירוע תואמת את תדירות האלקטרונים החופשיים המתנדנדים במתכת, מה שיוצר תהודה פלסמונית פני השטח (SPR). כאשר SPR מקומי (LSPR) מתרחש באמצעות לייזר האירוע הפוגע בננו-חלקיקי המתכת (NPs), זה מוביל לבליעת התהודה או פיזור של אור האירוע. כתוצאה מכך, עוצמת השדה האלקטרומגנטי על פני השטח של NPs מתכת יכולה להיות משופרת על ידי שניים עד חמישה סדרים4. עם זאת, המפתח לשיפור העצום ב- SERS אינו NP מתכתי יחיד, אלא הפער בין שני NPs, מה שיוצר נקודות חמות. CM נוצר משני צדדים, כולל (1) אינטראקציות בין מולקולות מטרה ו-NPs מתכתיים ו-(2) מולקולות מטרה המסוגלות להעביר אלקטרונים אל NPsמתכת 4,5 וממנה. פרטים ממצים יותר ניתן למצוא במאמרי סקירהאלה 4,5. מספר שיטות מבטיחות לחישה ביולוגית ודימות SERS בתאים חיים הוצגו בספרות קודמת, למשל, זיהוי תאים אפופטוטיים6, חלבונים באברונים7, miRNA תוך תאי8, קרומי שומנים תאיים,9 ציטוקינים10, ומטבוליטים 11 בתאים חיים, כמו גם זיהוי וניטור של תאים על ידי דימות SERS קונפוקלי2, 11,12,13. באופן מעניין, SERS ללא תוויות מציג את היתרון הייחודי של SERS, שיכול לתאר ספקטרום מולקולרי פנימי5.
בעיה מרכזית עבור SERS ללא תוויות היא מצע רציונלי ואמין. מצעי SERS טיפוסיים הם NPs מתכת אצילה בגלל היכולת המצוינת שלהם לפזר הרבה אור14. כיום, יותר ויותר תשומת לב מוקדשת לננו-מרוכבים בשל התכונות הפיזיקליות והכימיות המדהימות שלהם והתאימות הביולוגית. באופן משמעותי יותר, ננו-מרוכבים יכולים להראות פעילות SERS טובה יותר בגלל הקרינה האלקטרומגנטית האינטנסיבית הנגרמת על ידי הנקודות החמות בננו-היברידים ושיפור כימי נוסף שמקורו בחומרים אחרים שאינם מתכתיים15. לדוגמה, Fei et al. השתמשו בנקודות קוונטיות MoS 2 (QDs) כמפחיתים כדי לסנתז ננו-מרוכבים Au NP@MoS2QD עבור הדמיית SERS של תאי סרטן שד 4T1 של עכבר 4T1 (תאי 4T1)16. כמו כן, Li et al. יצרו מצע SERS דו-ממדי המורכב מננו-יריעות Au NPs ו-2D hafnium ditelluride למדידות SERS נטולות תוויות של חיידקים פתוגניים הנישאים במזון17. לאחרונה, נקודות פחמן (CDs), תורמי אלקטרונים טובים, שימשו כמפחיתים ללא רדוקטנטים אחרים או קרינה כדי לסנתז ננו-גשושיות Au@carbon נקודות (Au@CDs)18, אשר דווחו כחומרים יעילים לשיפור פעילות SERS בהתבסס על אפקט העברת מטען (CT) בין ליבות Au ופגזי CD19,20. יותר מזה, תקליטורים מוכרים כסוכן מכסה ומייצב כדי למנוע Au NPs לצבור21. בנוסף, הוא פותח אפשרויות נוספות לתגובות עם אנליטים, שכן הוא יכול לספק מספר רב של אתרים מחייבים ופעילים20. תוך ניצול האמור לעיל, Jin et al. פיתחו שיטה מהירה ונשלטת לייצור NPs Ag@CD עם תכונות SERS ייחודיות ופעילויות קטליטיות, מצוינות לניטור תגובות קטליטיות, הטרוגניות בזמן אמת18.
כאן הודגמה שיטה קלה וזולה לייצור מצעי SERS Au@CD מעטפת ליבה לזיהוי רכיבים תאיים והדמיה ביולוגית של תאים חיים ללא תוויות SERS, כמו גם לזיהוי והבחנה בין Escherichia coli (E. coli) ו– Staphylococcus aureus (S. aureus), הטומנת בחובה הבטחה לאבחון מוקדם של מחלות ולהבנה טובה יותר של תהליכים תאיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום, Au@CDs עם מעטפת CD דקה במיוחד של 2.1 ננומטר יוצרו בהצלחה. הננו-מרוכבים מראים רגישות SERS גבוהה יותר מאשר Au NPs טהורים. כמו כן, Au@CDs בעלי ביצועים מצוינים ביכולת שחזור ויציבות לטווח ארוך. מחקר נוסף כולל לקיחת Au@CDs כמצעים לביצוע הדמיית SERS של תאי A54931 ולאיתור שני זני חיידקים32</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32071399 ו-62175071), תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (2019050001), קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (2021A1515011988), והקרן הפתוחה של מעבדת המפתח למדע אופטואלקטרוניקה וטכנולוגיה לרפואה (אוניברסיטת פוג’יאן נורמל), משרד החינוך, סין (JYG2009).
Materials
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al. Understanding SERS of bacteria. Journal of Raman Spectroscopy. 40 (3), 277-288 (2009).
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman spectroscopy of biological tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42 (5), 493-541 (2007).
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q. Core-shell nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy. Chemical Reviews. 117 (7), 5002-5069 (2017).
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
