Bioanalyse de diffusion Raman sans marquage à surface améliorée basée sur des nanosondes à Au@Carbon points

Summary

Dans cette étude, nous avons développé une nanosonde d’empreintes digitales basée sur la diffusion Raman améliorée en surface (SERS) à faible coût avec une biocompatibilité favorable pour montrer la bioimagerie de cellules vivantes sans marquage et détecter deux souches bactériennes, montrant en détail comment obtenir des spectres SERS de cellules vivantes dans une méthode non destructive.

Abstract

La technologie de diffusion Raman améliorée en surface (SERS) attire de plus en plus l’attention dans le domaine biomédical en raison de sa capacité à fournir des informations moléculaires sur les empreintes digitales d’échantillons biologiques, ainsi que de son potentiel dans l’analyse de cellules uniques. Ce travail vise à établir une stratégie simple de bioanalyse SERS sans marquage basée sur Au@carbon nanosondes à points (Au@CDs). Ici, les CD dérivés de polyphénols sont utilisés comme réducteur pour synthétiser rapidement des nanostructures de noyau et de coquille Au@CD, ce qui permet de puissantes performances SERS même lorsque la concentration de bleu de méthylène (MB) est aussi faible que ^10-9 M, en raison du mécanisme coopératif d’amélioration Raman. Pour la bioanalyse, Au@CDs peut servir de nanocapteur SERS unique pour identifier les composants cellulaires des échantillons biologiques (par exemple, les cellules cancéreuses et les bactéries). Les empreintes moléculaires de différentes espèces peuvent être distinguées après combinaison avec l’analyse en composantes principales. En outre, Au@CDs permettent également l’imagerie SERS sans marquage pour analyser les profils de composition intracellulaire. Cette stratégie offre une bioanalyse SERS réalisable et sans marque, ouvrant de nouvelles perspectives pour le nanodiagnostic.

Introduction

L’analyse unicellulaire est essentielle pour l’étude de la révélation de l’hétérogénéité cellulaire et l’évaluation de l’état global de la cellule. La réponse instantanée de la cellule au microenvironnement justifie également une analyse unicellulaire¹. Cependant, il y a certaines limites aux techniques actuelles. La détection de fluorescence peut être appliquée à l’analyse d’une seule cellule, mais elle est limitée par une faible sensibilité. D’autres défis découlent du fond de fluorescence complexe des cellules et du photoblanchiment en fluorescence sous irradiation à long terme². La diffusion Raman améliorée en surface (SERS) peut être qualifiée en termes d’analyse unicellulaire en raison de ses avantages, notamment (1) reflétant les informations moléculaires intrinsèques de l’empreinte digitale et la situation instantanée, (2) sensibilité de surface ultra-élevée, (3) détection multiplex pratique, (4) photostabilité élevée, (5) détection peut être quantifiée pour une analyse comparative, (6) éviter l’autofluorescence cellulaire avec l’excitation de longueur d’onde NIR, (7) la détection peut être effectuée dans un aqueux cellulaire environnement, et (8) la détection peut être dirigée vers une région spécifique de la cellule ^3,4,5.

Il existe deux mécanismes largement reconnus pour comprendre le SERS comme un phénomène fondamental : l’amélioration électromagnétique (EM) comme raison dominante et l’amélioration chimique (CM). EM se réfère, dans une fréquence donnée du champ excitant, à l’oscillation d’électrons collectifs entraînés par des ondes électromagnétiques lorsque la fréquence de la lumière incidente correspond à la fréquence des électrons libres oscillant dans le métal, donnant lieu à la résonance plasmonique de surface (SPR). Lorsque la SPR localisée (LSPR) se produit par le laser incident qui frappe les nanoparticules métalliques (NP), elle conduit à l’absorption ou à la diffusion par résonance de la lumière incidente. Par conséquent, l’intensité du champ électromagnétique de surface des NP métalliques peut être augmentée de deux à cinq ordres⁴. Cependant, la clé de l’énorme amélioration du SERS n’est pas un seul NP métallique, mais l’écart entre deux NP, ce qui crée des points chauds. La CM est générée de deux côtés, y compris (1) les interactions entre les molécules cibles et les NP métalliques et (2) les molécules cibles capables de transférer des électrons vers/depuis les NP métalliques ^4,5. Des détails plus exhaustifs peuvent être trouvés dans ces articles ^4,5. Plusieurs méthodes prometteuses de biodétection et d’imagerie SERS dans les cellules vivantes ont été présentées dans la littérature antérieure, par exemple, la détection des cellules apoptotiques⁶, des protéines dans les organites⁷, des miARN intracellulaires⁸, des membranes lipidiques ^{cellulaires9,}des cytokines¹⁰ et des métabolites¹¹ dans les cellules vivantes, ainsi que l’identification et la surveillance des cellules par imagerie confocale SERS^{2, 11,12,13}. Fait intéressant, le SERS sans marquage présente l’avantage unique du SERS, qui peut décrire les spectres moléculaires internes⁵.

Un problème majeur pour le SERS sans étiquette est un substrat rationnel et fiable. Les substrats SERS typiques sont des NP de métaux nobles en raison de leur excellente capacité à diffuser beaucoup de lumière¹⁴. De nos jours, de plus en plus d’attention est accordée aux nanocomposites en raison de leurs propriétés physiques et chimiques remarquables et de leur biocompatibilité. Plus important encore, les nanocomposites peuvent présenter une meilleure activité SERS en raison de l’intense EM induite par les points chauds sur les nanohybrides et de l’amélioration chimique supplémentaire provenant d’autres matériaux non métalliques¹⁵. Par exemple, Fei et coll. ont utilisé des pointsquantiques MoS 2 (QD) comme réducteurs pour synthétiser des nanocomposites Au_{NP@MoS 2} QD pour l’imagerie SERS dans le proche infrarouge (NIR) sans marquage de cellules cancéreuses du sein 4T1 de souris (cellules 4T1)¹⁶. En outre, Li et al. ont fabriqué un substrat SERS 2D composé de NP Au et de nanofeuilles de ditellurure de hafnium 2D pour des mesures SERS sans marquage de bactéries pathogènes d’origine alimentaire¹⁷. Récemment, les points de carbone (CD), bons donneurs d’électrons, ont été utilisés comme réducteurs sans autres réducteurs ni irradiation pour synthétiser Au@carbon nanosondes à points (Au@CDs)¹⁸, qui ont été signalées comme des matériaux efficaces pour améliorer l’activité SERS basée sur l’effet de transfert de charge (CT) entre les noyaux Au et les coquilles CD^19,20. De plus, les CD sont reconnus comme l’agent de coiffage et un stabilisateur pour empêcher les NP Au d’agréger²¹. En outre, il ouvre plus de possibilités de réactions avec les analytes, car il peut fournir un grand nombre de sites de liaison et actifs²⁰. Tirant parti de ce qui précède, Jin et al. ont développé une méthode rapide et contrôlable pour fabriquer des NP Ag@CD dotés de propriétés SERS uniques et d’excellentes activités catalytiques pour surveiller des réactions catalytiques hétérogènes en temps réel¹⁸.

Ici, une méthode facile et peu coûteuse pour fabriquer des substrats de base Au@CD de SERS afin d’identifier les composants cellulaires et la bioimagerie de cellules vivantes SERS sans marque, ainsi que de détecter et de différencier Escherichia coli (E. coli) et Staphylococcus aureus (S. aureus) a été démontrée, ce qui est prometteur pour le diagnostic précoce de la maladie et une meilleure compréhension des processus cellulaires.

Protocol

1. Fabrication de Au@CDs REMARQUE : La figure 1 illustre une procédure de fabrication pour Au@CDs. Préparer la solution CD en utilisant de l’acide citrique (CA) et de l’acide gallique (AG) par un traitement hydrothermal typique18. Ajouter 100 μL de 3,0 mg mL-1 de la solution CD préparée dans 200 μL d’acide chloroaurique 10 mM (HAuCl4) (voir le tableau des matière…

Representative Results

La fabrication de la Au@CDs est illustrée à la figure 1. Les CD ont été préparés à partir d’AC et de GA par un procédé hydrothermal typique18. Au@CDs ont été rapidement synthétisés en réduisant HAuCl4 par des CD en milieu aqueux à température ambiante. La taille et la morphologie des CD et des Au@CDs peuvent être observées par TEM et TEM23 à haute résolution (HR). Les CD préparés son…

Discussion

En résumé, Au@CDs avec une coque CD ultramince de 2,1 nm ont été fabriquées avec succès. Les nanocomposites présentent une sensibilité SERS supérieure à celle des NP Au purs. En outre, Au@CDs possèdent d’excellentes performances en termes de reproductibilité et de stabilité à long terme. D’autres recherches comprennent la prise de Au@CDs comme substrats pour effectuer l’imagerie SERS des cellules A549³¹ et pour détecter deux souches bactériennes³². Il …

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw