Au@Carbonドットナノプローブに基づくラベルフリー表面増強ラマン散乱バイオアナリシス
Summary
本研究では、ラベルフリーの生細胞バイオイメージングを示し、2つの細菌株を検出するために、良好な生体適合性を有する低コストの表面増強ラマン散乱(SERS)ベースの指紋ナノプローブを開発し、非破壊法で生細胞のSERSスペクトルを取得する方法を詳細に示した。
Abstract
表面増強ラマン散乱(SERS)技術は、生体試料の分子フィンガープリント情報を提供できることや、シングルセル解析の可能性から、生物医学分野でますます注目を集めています。この研究は、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)に基づくラベルフリーSERSバイオアナリシスのための簡単な戦略を確立することを目的としています。ここでは、ポリフェノール由来のCDを還元剤として利用してコアシェルAu@CDナノ構造を迅速に合成し、協同ラマン増強機構により、メチレンブルー(MB)の濃度が10〜9 Mと低い場合でも強力なSERS性能を実現します。バイオ分析のために、Au@CDsは、バイオサンプルの細胞成分(例えば、癌細胞および細菌)を識別するためのユニークなSERSナノセンサーとして機能することができる。異なる種の分子フィンガープリントは、主成分分析との組み合わせ後にさらに区別することができます。さらに、Au@CDsは、細胞内組成プロファイルを分析するためのラベルフリーSERSイメージングも可能にします。この戦略は、実行可能なラベルフリーのSERSバイオアナリシスを提供し、ナノ診断の新たな展望を開きます。
Introduction
単一細胞解析は、細胞の不均一性を明らかにし、細胞の包括的な状態を評価する研究に不可欠です。微小環境に対する細胞の即時応答も、単一細胞解析を保証します1。ただし、現在の手法にはいくつかの制限があります。蛍光検出はシングルセル解析にも適用できますが、感度が低いという制約があります。他の課題は、細胞の複雑な蛍光バックグラウンドと長期照射下での蛍光光退色から生じます2。表面増強ラマン散乱(SERS)は、(1)固有の分子フィンガープリント情報と瞬間的な状況を反映する、(2)超高表面感度、(3)便利なマルチプレックス検出、(4)高い光安定性、(5)比較分析のために検出を定量できる、(6)NIR波長励起による細胞自家蛍光の回避、(7)検出は細胞水溶液で実行できる、などの利点があるため、単一細胞分析の観点から適格である可能性があります環境、および(8)検出は、細胞3、4、5内の特定の領域に向けることができる。
SERSを基本的な現象として理解するために広く認識されている2つのメカニズムがあります:支配的な理由としての電磁増強(EM)と化学的増強(CM)。EMとは、励起場の所定の周波数において、入射光の周波数が金属内で振動する自由電子の周波数と一致し、表面プラズモン共鳴(SPR)を引き起こすときに、電磁波によって駆動される集合電子の振動を指します。局在SPR(LSPR)が金属ナノ粒子(NP)に衝突する入射レーザーを介して発生すると、入射光の共鳴吸収または散乱につながります。その結果、金属NPの表面電磁界強度を2〜5桁向上させることができます4。ただし、SERSの大幅な強化の鍵は、単一の金属NPではなく、ホットスポットを作成する2つのNP間のギャップです。CMは、(1)標的分子と金属NPとの相互作用、(2)標的分子が金属NP4,5との間で電子を移動できることの2つの側面から生成されます。より網羅的な詳細は、これらのレビュー記事4,5に記載されています。生細胞におけるSERSバイオセンシングおよびイメージングのためのいくつかの有望な方法が以前の文献に提示されており、例えば、アポトーシス細胞6、細胞小器官7におけるタンパク質7、細胞内miRNAX8、細胞脂質膜9、サイトカイン10、および生細胞における代謝産物11の検出、ならびに共焦点SERSイメージング2による細胞の同定およびモニタリング、 11、12、13。興味深いことに、ラベルフリーSERSは、内部分子スペクトル5を記述できるSERSのユニークな利点を提供します。
ラベルフリーSERSの大きな問題は、合理的で信頼性の高い基質です。典型的なSERS基板は、多くの光を散乱させる優れた能力があるため、貴金属NPです14。今日では、その顕著な物理的および化学的特性および生体適合性のために、ナノコンポジットにますます注目が払われている。さらに重要なことに、ナノコンポジットは、ナノハイブリッド上のホットスポットによって誘発される強烈なEMおよび他の非金属材料に由来する追加の化学的増強のために、より良好なSERS活性を示すことができる15。例えば、Feiらは、マウス4T1乳がん細胞(4T1細胞)のラベルフリー近赤外(NIR)SERSイメージングのために、Au NP@MoS 2 QDナノコンポジットを合成するための還元剤としてMoS2量子ドット(QD)を使用しました16。また、Liらは、食品媒介病原菌のラベルフリーSERS測定のために、Au NPsと2Dハフニウムジテルル化物ナノシートからなる2D SERS基板を作製した17。近年、良好な電子供与体であるカーボンドット(CD)が、他の還元体や照射を伴わずに還元体として使用され、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)18を合成し、AuコアとCDシェル間の電荷移動(CT)効果に基づいてSERS活性を高める効率的な材料であることが報告されています19,20。それ以上に、CDはキャッピング剤およびAu NPが凝集するのを防ぐための安定剤として認識されています21。さらに、それは多数の結合部位および活性部位を提供することができるので、分析物との反応のためのより多くの可能性を開く20。上記を利用して、Jinらは、不均一な触媒反応をリアルタイムで監視するための独自のSERS特性と優れた触媒活性を備えたAg@CD NPを製造するための高速で制御可能な方法を開発しました18。
ここでは、コアシェルAu@CD SERS基質を作製して細胞成分を同定し、ラベルフリーのSERS生細胞バイオイメージング、ならびに 大腸菌 (大腸菌)と黄色 ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌)を検出および鑑別するための簡単で低コストの方法が実証され、疾患の早期診断と細胞プロセスのより良い理解に有望です。
Protocol
Representative Results
Discussion
要約すると、2.1nmの超薄型CDシェルを備えたAu@CDsが正常に製造されました。ナノコンポジットは、純粋なAu NPよりも優れたSERS感度を示します。また、Au@CDs再現性と長期安定性に優れた性能を持っています。さらなる研究には、A549細胞31のSERSイメージングを実行し、2つの細菌株32を検出するための基質としてAu@CDsを取ることが含まれる。Au@CDsは、主にAu NPとCD?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(32071399および62175071)、広州科学技術プログラム(2019050001)、広東基礎応用基礎研究財団(2021A1515011988)、および中国教育省(福建師範大学)の医学のための光電子科学技術の主要研究所のオープン財団(JYG2009)の支援を受けました。
Materials
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
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