Bioanálise de espalhamento Raman sem superfície com base em nanossondas de Au@Carbon pontos

Summary

Neste estudo, desenvolvemos uma nanossonda de impressão digital baseada em espalhamento Raman (SERS) de baixo custo com biocompatibilidade favorável para mostrar bioimagem de células vivas livre de marcação e detectar duas cepas bacterianas, mostrando em detalhes como obter espectros SERS de células vivas em um método não destrutivo.

Abstract

A tecnologia de espalhamento Raman aprimorado por superfície (SERS) tem atraído cada vez mais atenção no campo biomédico devido à sua capacidade de fornecer informações moleculares de impressões digitais de amostras biológicas, bem como seu potencial em análises de célula única. Este trabalho visa estabelecer uma estratégia simples para bioanálise SERS livre de marcação baseada em nanossondas de Au@carbon pontos (Au@CDs). Aqui, CDs derivados de polifenóis são utilizados como redutor para sintetizar rapidamente nanoestruturas de Au@CD núcleo-casca, o que permite um poderoso desempenho SERS mesmo quando a concentração de azul de metileno (MB) é tão baixa quanto ^10-9 M, devido ao mecanismo cooperativo de realce Raman. Para a bioanálise, Au@CDs pode servir como um nanossensor SERS exclusivo para identificar os componentes celulares de bioamostras (por exemplo, células cancerosas e bactérias). As impressões digitais moleculares de diferentes espécies podem ser distinguidas após a combinação com a análise de componentes principais. Além disso, Au@CDs também permitem imagens SERS sem marcação para analisar perfis de composição intracelular. Essa estratégia oferece uma bioanálise SERS viável e livre de marcas, abrindo uma nova perspectiva para o nanodiagnóstico.

Introduction

A análise unicelular é essencial para o estudo da revelação da heterogeneidade celular e para a avaliação do estado abrangente da célula. A resposta instantânea da célula ao microambiente também justifica a análise de célula única¹. No entanto, existem algumas limitações para as técnicas atuais. A detecção de fluorescência pode ser aplicada à análise de célula única, mas é limitada pela baixa sensibilidade. Outros desafios surgem do complicado fundo de fluorescência das células e do fotoclareamento por fluorescência sob irradiação de longa duração². O espalhamento Raman intensificado por superfície (SERS) pode se qualificar em termos de análise de célula única devido às suas vantagens, incluindo (1) refletir a informação intrínseca da impressão digital molecular e a situação instantânea, (2) sensibilidade superficial ultra-alta, (3) detecção multiplex conveniente, (4) alta fotoestabilidade, (5) detecção pode ser quantificada para análise comparativa, (6) evitar a autofluorescência celular com a excitação do comprimento de onda NIR, (7) a detecção pode ser realizada em um aquoso celular e (8) a detecção pode ser direcionada para uma região específica dentro da célula ^3,4,5.

Existem dois mecanismos amplamente reconhecidos para entender o SERS como um fenômeno fundamental: o realce eletromagnético (ME) como razão dominante e o realce químico (CM). EM refere-se, em uma dada frequência do campo excitante, à oscilação de elétrons coletivos impulsionados por ondas eletromagnéticas quando a frequência da luz incidente coincide com a frequência de elétrons livres oscilando no metal, dando origem à ressonância plasmônica de superfície (SPR). Quando a SPR localizada (LSPR) ocorre através do laser incidente colidindo com as nanopartículas metálicas (NPs), leva à absorção ou espalhamento ressonante da luz incidente. Consequentemente, a intensidade do campo eletromagnético superficial dos NPs metálicos pode ser aumentada em duas a cinco ordens⁴. No entanto, a chave para o enorme aprimoramento no SERS não é um único NP de metal, mas a lacuna entre dois NPs, o que cria pontos quentes. O MC é gerado a partir de dois lados, incluindo (1) interações entre moléculas-alvo e NPs metálicos e (2) moléculas-alvo capazes de transferir elétrons de/para NPs metálicos ^4,5. Detalhes mais exaustivos podem ser encontrados nesses artigos de revisão ^4,5. Vários métodos promissores para biosensoriamento e imagem de SERS em células vivas foram apresentados na literatura anterior, por exemplo, a detecção de células apoptóticas⁶, proteínas em organelas⁷, miRNAs intracelulares⁸, membranas lipídicas ^celulares9,citocinas¹⁰ e metabólitos¹¹ em células vivas, bem como a identificação e monitoramento de células por imagens confocais SERS^{2, 11,12,13}. Curiosamente, o SERS livre de rótulos apresenta a vantagem única do SERS, que pode descrever espectros moleculares internos⁵.

Um grande problema para o SERS sem rótulo é um substrato racional e confiável. Os substratos SERS típicos são NPs de metais nobres devido à sua excelente capacidade de espalhar muita luz¹⁴. Atualmente, cada vez mais atenção é dada aos nanocompósitos devido às suas notáveis propriedades físico-químicas e biocompatibilidade. Mais significativamente, os nanocompósitos podem apresentar melhor atividade de SERS devido ao intenso EM induzido pelos pontos quentes nos nanohíbridos e ao aumento químico adicional proveniente de outros materiais não metálicos¹⁵. Por exemplo, Fei e col. usaram pontos quânticos (QDs) MoS 2 como redutores para sintetizar nanocompósitos Au NP@MoS₂QD para imagens SERS de infravermelho próximo (NIR) livres de marcação de células de câncer de mama 4T1 de camundongo (células 4T1)¹⁶. Além disso, Li e col. fabricaram um substrato SERS 2D consistindo de NPs de Au e nanofolhas de ditelureto de háfnio 2D para medidas SERS livres de rótulos de bactérias patogênicas transmitidas por alimentos¹⁷. Recentemente, pontos de carbono (CDs), bons doadores de elétrons, têm sido usados como redutores sem outros redutores ou irradiação para sintetizar nanossondas de Au@carbon pontos (Au@CDs)¹⁸, que têm sido relatados como materiais eficientes para aumentar a atividade do SERS com base no efeito de transferência de carga (CT) entre núcleos de Au e cascas de CD^19,20. Mais do que isso, os CDs são reconhecidos como o agente de tampamento e um estabilizador para evitar que os NPs de Au agreguem²¹. Além disso, abre mais possibilidades de reações com analitos, pois pode fornecer um grande número de sítios de ligação e ativos²⁰. Aproveitando o exposto, Jin e col. desenvolveram um método rápido e controlável para fabricação de NPs Ag@CD com propriedades SERS únicas e excelentes atividades catalíticas para monitorar reações catalíticas heterogêneas em tempo real¹⁸.

Neste trabalho, foi demonstrado um método fácil e de baixo custo para a fabricação de substratos SERS Au@CD core-shell para identificar componentes celulares e bioimagem de células vivas SERS livres de marcação, bem como para detectar e diferenciar Escherichia coli (E. coli) e Staphylococcus aureus (S. aureus), o que é promissor para o diagnóstico precoce da doença e uma melhor compreensão dos processos celulares.

Protocol

1. Fabricação de Au@CDs NOTA: A Figura 1 ilustra um procedimento de fabricação para Au@CDs. Preparar solução de CD usando ácido cítrico (CA) e ácido gálico (GA) através de um procedimento típico de tratamento hidrotérmico18. Adicionar 100 μL de 3,0 mg mL-1 da solução de CD preparada em 200 μL de ácido cloroáurico 10 mM (HAuCl4) (ver Tabela de Materiais</str…

Representative Results

A fabricação do Au@CDs está ilustrada na Figura 1. Os CDs foram preparados a partir de CA e GA através de um processo hidrotermal típico18. Au@CDs foram rapidamente sintetizados pela redução do HAuCl4 por CDs em meio aquoso à temperatura ambiente. O tamanho e a morfologia das CDs e Au@CDs podem ser observados por ETM e MET de alta resolução (HR)23. Os CDs preparados são monodispersos com tamanhos …

Discussion

Em resumo, Au@CDs com um shell de CD ultrafino de 2,1 nm foram fabricadas com sucesso. Os nanocompósitos apresentam sensibilidade SERS superior às NPs puras de Au. Além disso, Au@CDs possuem excelente desempenho em reprodutibilidade e estabilidade a longo prazo. Outras pesquisas incluem tomar Au@CDs como substratos para realizar imagens SERS de células A549³¹ e detectar duas cepas bacterianas³². Foi provado que Au@CDs pode ser usado como uma sonda SERS ultrassensível p…

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw