Bioanálisis de dispersión Raman mejorada en superficie sin etiquetas basado en nanosondas de Au@Carbon puntos

Summary

En este estudio, desarrollamos una nanosonda de huellas dactilares basada en dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) de bajo costo con biocompatibilidad favorable para mostrar bioimágenes de células vivas sin marcadores y detectar dos cepas bacterianas, mostrando en detalle cómo obtener espectros SERS de células vivas en un método no destructivo.

Abstract

La tecnología de dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) ha atraído cada vez más atención en el campo biomédico debido a su capacidad para proporcionar información de huellas moleculares de muestras biológicas, así como a su potencial en el análisis de una sola célula. Este trabajo tiene como objetivo establecer una estrategia simple para el bioanálisis de SERS sin marcaje basada en nanosondas de puntos Au@carbon (Au@CDs). Aquí, los CD derivados de polifenoles se utilizan como reductor para sintetizar rápidamente nanoestructuras de Au@CD núcleo-capa, lo que permite un potente rendimiento de SERS incluso cuando la concentración de azul de metileno (MB) es tan baja como ^10-9 M, debido al mecanismo cooperativo de mejora Raman. Para el bioanálisis, Au@CDs puede servir como un nanosensor SERS único para identificar los componentes celulares de las muestras biológicas (por ejemplo, células cancerosas y bacterias). Las huellas moleculares de diferentes especies se pueden distinguir aún más después de la combinación con el análisis de componentes principales. Además, Au@CDs también permiten obtener imágenes SERS sin etiquetas para analizar los perfiles de composición intracelular. Esta estrategia ofrece un bioanálisis SERS factible y sin marcas, lo que abre una nueva perspectiva para el nanodiagnóstico.

Introduction

El análisis de una sola célula es esencial para el estudio de la revelación de la heterogeneidad celular y la evaluación del estado integral de la célula. La respuesta instantánea de la célula al microambiente también justifica el análisis de una sola célula¹. Sin embargo, existen algunas limitaciones en las técnicas actuales. La detección de fluorescencia se puede aplicar al análisis de una sola célula, pero está limitada por la baja sensibilidad. Otros desafíos surgen del complicado fondo de fluorescencia de las células y el fotoblanqueo de fluorescencia bajo irradiación a largo plazo². La dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) puede calificar en términos de análisis de una sola célula debido a sus ventajas, que incluyen (1) reflejar la información intrínseca de la huella dactilar molecular y la situación instantánea, (2) sensibilidad superficial ultra alta, (3) detección múltiplex conveniente, (4) alta fotoestabilidad, (5) la detección se puede cuantificar para análisis comparativo, (6) evitar la autofluorescencia celular con la excitación de longitud de onda NIR, (7) la detección se puede realizar en un acuoso celular y (8) la detección se puede dirigir a una región específica dentro de la célula ^3,4,5.

Existen dos mecanismos ampliamente reconocidos para entender el SERS como un fenómeno fundamental: el realce electromagnético (EM) como razón dominante y el realce químico (MC). EM se refiere, en una frecuencia dada del campo de excitación, a la oscilación de electrones colectivos impulsados por ondas electromagnéticas cuando la frecuencia de la luz incidente coincide con la frecuencia de los electrones libres que oscilan en el metal, dando lugar a la resonancia de plasmones superficiales (SPR). Cuando la SPR localizada (LSPR) se produce a través del láser incidente que incide en las nanopartículas metálicas (NP), conduce a la absorción o dispersión resonante de la luz incidente. En consecuencia, la intensidad del campo electromagnético superficial de los NP metálicos puede aumentarse de dos a cinco órdenes⁴. Sin embargo, la clave de la enorme mejora en SERS no es un solo NP de metal, sino el espacio entre dos NP, lo que crea puntos calientes. La CM se genera a partir de dos lados, incluyendo (1) las interacciones entre las moléculas diana y las NPs metálicas y (2) las moléculas diana que son capaces de transferir electrones hacia/desde las NPs metálicas ^4,5. Se pueden encontrar detalles más exhaustivos en estos artículos de revisión ^4,5. En la literatura previa se han presentado varios métodos prometedores para la biodetección y la obtención de imágenes de SERS en células vivas, por ejemplo, la detección de células apoptóticas⁶, proteínas en orgánulos⁷, miARN intracelulares⁸, membranas lipídicas ^celulares,9citocinas¹⁰ y metabolitos¹¹ en células vivas, así como la identificación y monitorización de células mediante imágenes SERS^{confocales 2, 11,12,13}. Curiosamente, el SERS sin etiquetas presenta la ventaja única del SERS, que puede describir espectros moleculares internos⁵.

Un problema importante para los SERS sin etiquetas es un sustrato racional y confiable. Los sustratos SERS típicos son NP de metales nobles debido a su excelente capacidad para dispersar una gran cantidad de luz¹⁴. Hoy en día, se presta cada vez más atención a los nanocompuestos debido a sus notables propiedades físicas y químicas y su biocompatibilidad. Y lo que es más importante, los nanocompuestos pueden mostrar una mejor actividad SERS debido a la intensa EM inducida por los puntos calientes de los nanohíbridos y a la mejora química adicional procedente de otros materiales no metálicos¹⁵. Por ejemplo, Fei et al. utilizaron puntos cuánticos (QD) MoS 2 como reductores para sintetizar nanocompuestos de Au NP@MoS₂QD para obtener imágenes SERS de infrarrojo cercano (NIR) sin etiquetas de células de cáncer de mama 4T1 de ratón (células 4T1)¹⁶. Además, Li et al. fabricaron un sustrato SERS 2D que consistía en NPs de Au y nanoláminas de diteluro de hafnio 2D para mediciones SERS sin marcaje de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos¹⁷. Recientemente, los puntos de carbono (CD), buenos donantes de electrones, se han utilizado como reductores sin otros reductores o irradiación para sintetizar nanosondas de puntos de Au@carbon (Au@CDs)¹⁸, que se ha informado que son materiales eficientes para mejorar la actividad de SERS basada en el efecto de transferencia de carga (CT) entre los núcleos de Au y las capas de CD^19,20. Más que eso, los CD son reconocidos como el agente de recubrimiento y un estabilizador para evitar que los Au NP agreguen²¹. Además, abre más posibilidades de reacciones con analitos, ya que puede proporcionar un gran número de sitios de unión y activos²⁰. Aprovechando lo anterior, Jin et al. desarrollaron un método rápido y controlable para la fabricación de NPs Ag@CD con propiedades SERS únicas y excelentes actividades catalíticas para monitorear reacciones catalíticas heterogéneas en tiempo real¹⁸.

En este trabajo, se demostró un método fácil y de bajo costo para fabricar sustratos de SERS Au@CD core-shell para identificar componentes celulares y bioimágenes de células vivas SERS sin marcadores, así como para detectar y diferenciar Escherichia coli (E. coli) y Staphylococcus aureus (S. aureus), que es prometedor para el diagnóstico temprano de enfermedades y una mejor comprensión de los procesos celulares.

Protocol

1. Fabricación de Au@CDs NOTA: La Figura 1 ilustra un procedimiento de fabricación para Au@CDs. Prepare la solución de CD utilizando ácido cítrico (CA) y ácido gálico (GA) mediante un procedimiento típico de tratamiento hidrotermal18. Añadir 100 μL de 3,0 mg mL-1 de la solución de CD preparada en 200 μL de ácido cloroáurico 10 mM (HAuCl4) (ver Tabla de Materiale…

Representative Results

La fabricación del Au@CDs se ilustra en la Figura 1. Los CD se prepararon a partir de CA y AG a través de un proceso hidrotermal típico18. Au@CDs sintetizaron rápidamente mediante la reducción de HAuCl4 por CD en medios acuosos a temperatura ambiente. El tamaño y la morfología de los CD y Au@CDs pueden ser observados por TEM y TEM23 de alta resolución. Los CD preparados son monodispersos con tamaño…

Discussion

En resumen, se han fabricado con éxito Au@CDs con una carcasa de CD ultrafina de 2,1 nm. Los nanocompuestos muestran una sensibilidad SERS superior a la de los NP de Au puros. Además, Au@CDs poseen un excelente rendimiento en reproducibilidad y estabilidad a largo plazo. Otras investigaciones incluyen la toma de Au@CDs como sustratos para realizar imágenes SERS de células A549³¹ y para detectar dos cepas bacterianas³². Se ha demostrado que Au@CDs puede utilizarse como u…

Materials

10x PBS buffer (Cell culture)	Langeco Technology	BL316A
6 well cell culture plate	LABSELECT	11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	GLPBIO	GK10001
Citric acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	C108869
CO2 incubator	Thermo Fisher Technologies	3111
Constant temperature magnetic agitator	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Cryogenic high speed centrifuge	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium	Procell	PM150210
Electronic balance	Sartorius Scientific Instruments	SQP
Enzyme marker	Thermo Fisher Technologies	3111
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biological Technology	11011-8611
Figure 1	Figdraw.
Fourier infrared spectrometer	Thermo, America	Nicolet 380
Freeze dryer	Tecan	Infinite F50
Gallic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	G104228
Handheld Raman spectrometer	OCEANHOOD, Shanghai, China	Uspectral-PLUS
HAuCl4	Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope	Thermo Fisher Technologies	FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Yongxin Optical	XD-202
LB Broth BR	Huankai picoorganism	028320
Medical ultra-low temperature refrigerator	Thermo Fisher Technologies	ULTS1368
Methylene blue	Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution	beyotime	C0207
Penicillin streptomycin double resistance	Shanghai Boxun	YXQ-LS-50S
Pure water meter	Millipore, USA	Milli-Q System
Raman spectrometer	Renishaw
Sapphire chip	beyotime
Thermostatic water bath	Changzhou Noki
Ultra-clean table	Shanghai Boxun	SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer	MADAPA, China	UV-6100S
Wire 3.4	Renishaw