Ett unikt, omfattande protokoll för att generera de-sialylerade humana monocyt-härledda dendritiska celler (mo-DC) från isolerade mononukleära celler i perifert blod (PBMC) med hjälp av en sialidasbehandling presenteras. Vidare beskrivs metoder för att bedöma den fenotypiska och funktionella karakteriseringen av mo-DCs och utvärdera hur sialidasbehandling förbättrar mognadsnivån av mo-DCs.
Sialinsyror är negativt laddade monosackarider som vanligtvis finns vid cellytans glykaners ändpunkter. På grund av deras hydrofilicitet och biofysiska egenskaper är de involverade i många biologiska processer, såsom modulering av immunsvaret, igenkänning av själv- och icke-självantigener, kolhydrat-proteininteraktioner, etc. Det cellulära innehållet av sialinsyra regleras av sialidas, som katalyserar avlägsnandet av sialinsyrarester. Flera studier har visat att sialo-glykaner är avgörande för att övervaka immunövervakning genom att engagera cis – och transhämmande Siglec-receptorer på immunceller. På samma sätt håller glykoimmuna kontrollpunkter i cancer på att bli viktiga mål för att utveckla immunterapier. Dessutom är dendritiska celler (DC) tänkta som en viktig komponent i immunterapier, särskilt inom cancerforskning, på grund av deras unika roll som professionella antigenpresenterande celler (APC) och deras förmåga att utlösa adaptiva immunsvar och generera immunologiskt minne. DC:s funktion är dock beroende av deras fulla mognad. Omogna DC:er har en motsatt funktion till mogna DC:er och en hög halt av sialinsyra, vilket ytterligare dämpar deras mognadsnivå. Detta nedreglerar förmågan hos omogna DCs att aktivera T-celler, vilket leder till ett försvagat immunsvar. Följaktligen inducerar avlägsnande av sialinsyra från cellytan på humana DCs deras mognad, vilket ökar uttrycket av MHC-molekyler och antigenpresentation. Dessutom kan det återställa uttrycket av co-stimulerande molekyler och IL-12, vilket resulterar i att DCs har en högre förmåga att polarisera T-celler mot en Th1-fenotyp och specifikt aktivera cytotoxiska T-celler för att döda tumörceller. Därför har sialinsyra dykt upp som en nyckelmodulator av DCs och används som ett nytt mål för att främja deras terapeutiska användning. Denna studie ger ett unikt tillvägagångssätt för att behandla in vitro-monocythärledda DC med sialidas, som syftar till att generera DC-populationer med olika cellyte-sialinsyrafenotyper och skräddarsydda mognads- och co-stimulerande profiler.
Sialinsyrabärande glykaner (sialoglykaner) har fått stort intresse på grund av deras immunmodulerande roll. Monosackariden sialinsyra, som är vanligast hos människor i form av N-acetylneuraminsyra, presenterar grundläggande ligander för lektiner med en erkänd roll inom immunologi, såsom Selectins och Siglecs. Dessa lektiner känner igen sialoglykaner antingen på samma cell (cis) eller på olika celler (trans) och spelar en viktig roll i värd-patogeninteraktioner och olika fysiologiska och patologiska cellulära aktiviteter 1,2,3. Dessutom, eftersom sialinsyra upptar de terminala positionerna för cellyteglykokonjugat, kan den dölja de underliggande strukturerna och därmed hämma cell-till-cell-kontakt via icke-specifika repulsiva effekter eller genom att hindra detektion av andra lektiner4. Aktiviteten hos en mängd olika sialyltransferaser (som överför sialinsyror) och sialidaser (som klyver sialinsyrabindningar) i cellen bestämmer mängden sialinsyra som finns på ytan. Dessutom kan lösliga sialyltransferaser och sialidaser som uttrycks av värden eller patogener extrinsiskt modifiera mängden sialinsyra på cellytan 5,6.
Avvikande sialylering är ett kännetecken för flera patologiska tillstånd. Vid autoimmuna sjukdomar kan hyposialylering bidra till ohämmad immunaktivering och organskador, eftersom sialinsyra hjälper till att diskriminera självantigener och reglera inflammatoriskareaktioner. Omvänt resulterar hypersialylering i överuttryck av sialoglykaner, såsom sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialinsyra och gangliosider, vilket utgör ett kännetecken för vissa cancerformer 8,9. Hypersialylering beror också på ökat uttryck av specifika enzymer såsom N-acetylglukosaminyltransferas (GNT-V), som genererar hypersialylerade tri- och/eller tetraantennära N-kopplade glykaner, som har associerats med cancertillväxt och metastasering10. Innehållet av sialinsyra reglerar också proteinets stabilitet och funktion, vilket är avgörande för relevanta onkogena aktörers roll11. Därför kan ökad sialylering underlätta tumörutveckling, metastasering, läkemedelsresistens och immunflykt. Dessutom gör uppregleringen av sialoglykaner det möjligt för tumörer att interagera med hämmande Siglec-receptorer på immunceller och undvika immunövervakning. Av den anledningen anses sialoglykaner nu vara glykoimmuna kontrollpunkter och attraktiva terapeutiska mål. Till exempel befinner sig hämmare av Siglec-immunaxeln redan i tidiga kliniska prövningar, eftersom immuncellsreceptorn Siglec (sialicsyrabindande ImmunoGlobulin-like LECtin) spelar en immunhämmande roll12.
Enzymer har använts för att modulera glykanprofilen som verktyg för studier eller för terapeutiska strategier13,14. Sialidas har använts för att förändra cancercellers malignitet eftersom sialylerade glykaner såsom sialyl Lewis X är avgörande för cellmigration och cancermetastasering15. Samtidigt har sialidashämmare, som hindrar sialinsyraklyvning, nått kliniker för behandling av sialinsyraberoende virusinfektioner16. På senare tid har sialinsyramodulering fått ytterligare intresse på grund av sialinsyrornas kritiska roll som ligander i Siglec-immunaxeln, vilket innebär att de erbjuder nya sätt att minska cancerflykt från immunsvar. Detta intresse förstärktes ytterligare av 2022 års Nobelpristagare Bertozzi och hennes teams bidrag med flera strategier som selektivt klyver olika sialoglykaner och förbättrar immunsvaret mot cancer17. Således representerar sialidasbaserade strategier en lovande modalitet för glykoimmun checkpoint-terapi. Glykofenotypen hos celler i immunsystemet är beroende av typen av cell och deras aktiveringsstatus. När det gäller T-celler har glykaner en nyckelroll i de patofysiologiska stegen för T-cellsutveckling och tymocytselektion, T-cellsaktivitet, differentiering och proliferation18. Till exempel påverkar polylaktosamin på glykoproteiner basala nivåer av B-lymfocyter och T-lymfocyter och makrofagaktivering19. I makrofager har distinkta glykanuttrycksmönster en viktig roll i makrofagrekryteringen till tumörens mikromiljö (TME)20. Därför kan immuncellers uttryck av O- och N-kopplade glykaner användas som potentiella glykobiomarkörer för terapeutiska metoder vid behandling av cancer och autoimmuna sjukdomar.
Dendritiska celler (DC) är specifika antigenpresenterande celler med en unik förmåga att utlösa immunsvar, såsom anti-cancerimmunitet21. DCs måste genomgå en uppreglering av sina antigenpresenterande MHC-molekyler för att presentera antigener för T-celler (signal 1), co-stimulerande molekyler för att aktivera T-celler (signal 2) och proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-12, för att utlösa typ 1-hjälpar-T-cellsproliferation (signal 3)22. Den resulterande immunprofilen är strikt reglerad, och kontrollpunkter är viktiga för att förhindra att friska celler attackeras. Eftersom DC kan stimulera olika immunsvar mot tumörceller används de som cellbaserade vacciner, och ett stort antal kliniska studier har visat deras potentiella fördelar23,24. Efter att FDA godkände det första DC-baserade vaccinet 201025,26 har många andra DC-baserade vacciner utvecklats. DC-baserade vacciner produceras huvudsakligen ex vivo och administreras till patienter för att framkalla immunsvar mot tumörer. Otillräcklig eller kort mognad är dock för närvarande en av de faktorer som begränsar den kliniska effekten av DCs och innebär att dyra cytokincocktails måste användas. Utan adekvat mognad kan DCs inte aktivera T-celler under kliniska omständigheter. Istället uttrycker DC:erna immunkontrollpunkter och utlöser ett tolerogent immunsvar som hindrar cytotoxiska T-celler från att verka mot tumörceller.
Humana DCs har kraftigt sialylerade ytor, och denna sialylering minskar vid mognad och under ett övergripande immunsvar27. Mognaden av DCs kan induceras genom att eliminera dessa sialinsyror med sialidas. Desialylering uppreglerar i hög grad olika cytokiner, inklusive IL-12, på grund av translokationen av NF-kB-transkriptionsfaktorn till kärnan 6,28. Dessutom förbättrar desialylering antigenkorspresentation genom MHC-I och antitumörimmunsvar29,30. Följaktligen genererar knockouten av sialyltransferaserna ST3Gal.l och ST6Gal.l, som har en viktig roll i DC-sialylering, en mer mogen fenotyp i murina DCs31.
Silidasbehandling ger en metod för att stimulera alla aspekter av DC-mognad, inklusive ökad antigenpresentation, ökat uttryck av co-stimulerande molekyler och ökad cytokinproduktion, för att åtgärda de brister som nämns ovan och göra det möjligt för DCs att framkalla effektiva svar. I den här artikeln presenteras en procedur för att erhålla livskraftiga desialylerade humana DCs genom användning av ett bakteriellt sialidas. De-sialylerade DCs visar en förbättrad mognadsprofil och kan användas som cellmodeller för att öka immunsvaret mot tumörer in vitro. DCs erhålls från blodmonocyter, som sedan differentieras in vitro i närvaro av cytokinen interleukin-4 (IL-4) och granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Detta arbete beskriver också lektinbaserade metoder för att analysera sialinsyra på cellytan och metoder för att immunofenotypa DC-mognadsnivån. Proceduren som beskrivs här kan användas för att desialysera andra celltyper, vilket ger ett tillvägagångssätt för att undersöka rollen för sialoglykaner, som är viktiga glykoimmuna kontrollpunkter och relevanta för immunmodulering.
Isolering av monocyter
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att generera mo-DCs från humanisolerade monocyter CD14+ (Figur 1A), följt av att utföra en sialidasbehandling för att minska sialinsyrahalten på ytan av dessa celler.
Det finns olika sätt att erhålla humana DC, t.ex. direkt från perifert blod eller perifera vävnader eller genom differentiering från förstadier som stamceller eller monocyter. Att erhålla DC differentierat från monocyter isolerade från perifert blod är mycket enklare på grund av att det är lätt att erhålla stora mängder monocyter jämfört med andra DC-källor41. Ändå, för att få en hög andel isolerade monocyter, måste alla protokollsteg följas noggrant. Till exempel kan densitetsgradientmediet vara giftigt för cellerna, och för att förhindra celldöd måste man undvika långvarig cellkontakt med densitetsgradientmediet och tvätta cellerna noggrant. Cellmanipulation måste göras så snabbt som möjligt för att undvika förlust av cellviabilitet. Från PBMC kan monocyter isoleras genom positiv selektion med hjälp av MACS-metoden (magnetic-activated cell sorting), som är en lämplig teknik för att ge ett stort antal monocyter. Dessutom, jämfört med andra metoder för selektion av monocyter, har mo-DCs som härrör från MACS-isolerade monocyter en större förmåga att stimulera anti-tumör-T-cellsaktivitet42. I detta protokoll, när monocyterna väl hade isolerats, inkuberades de med IL-4 och GM-CSF under en period av 5-6 dagar för att uppnå differentieringen till omogna mo-DC (Figur 1). Resultaten visade att morfologiskt (Figur 1A) och fenotypiskt (Figur 1B) differentierade de isolerade monocyterna till omogna mo-DCs. Dessutom, under hela differentieringen, förlorade mo-DC:erna uttrycket av CD14-markörer och fick uttrycket av CD1a och MHC-II (Figur 1B), som krävs för antigenpresentation för T-celler.
Denna isolering och differentiering av monocyter till mo-DC är begränsningar för detta protokoll. Isoleringsprocessen är ett känsligt steg som måste utföras noggrant och snabbt för att undvika celldöd, och detta steg måste också göras varje gång mo-DCs behövs för ett nytt experiment. Differentieringsprocessen tar 5-6 dagar, vilket innebär en svårighet när det gäller att använda denna metod för analyser med hög genomströmning. Icke desto mindre är isoleringsmetoden och användningen av cytokiner för att differentiera mo-DCs användbara för att generera ett stort antal funktionella mo-DCs in vitro för experimentändamål. De mo-DCs som genereras i detta protokoll kan genomgå sialidasbehandling, flödescytometri, ELISA, konfokalmikroskopi och så vidare, vilket understryker vikten och användbarheten av denna metod30.
Omogen mo-DC- och sialidasbehandling
Silidaser är viktiga för sialyleringsreglering och är ansvariga för att avlägsna sialinsyror från cellytans glykaner. I mo-DC leder avlägsnande av sialinsyra med sialidas till mognad av dessa celler, vilket ökar antigenkorspresentationen och efterföljande T-cellsaktivering och antitumöraktivitet30.
Omogna humana mo-DCs uppvisar ett högt innehåll av cellyte-α(2,6)- och α(2,3)-bundna sialinsyror27 jämfört med mogna mo-DCs 31,43. Avlägsnande av sialinsyror genom att behandla mo-DCs med sialidas förbättrar dessutom mognaden av DCs 28,30,31. Det sialidas som valdes ut för detta experiment kom från bakterien Clostridium perfringens. Ändå producerar andra organismer också sialidaser, såsom bakterierna Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, blodigeln Macrobdella decora45 och till och med Homo sapiens46, och sialidaser från dessa organismer används också experimentellt. Varje sialidas har dock olika substratspecificiteter. Dessutom kan användningen av enzymet sialidas ha sina begränsningar; Till exempel kan manipulation av mo-DCs under behandlingen ytterligare stimulera dessa celler. Dessutom måste mängden sialidas och inkubationstiderna optimeras baserat på vilken typ av celler som används och deras sialinsyrasammansättning. Avlägsnandet av sialinsyra är inte en permanent effekt utan snarare ett övergående fenomen, eftersom cellen kommer att återställa sitt innehåll av sialinsyra på cellytan. Förutom sialidas, finns det andra metoder för att reducera sialinsyramolekylerna på cellytan, såsom att använda sialyltransferashämmare, genknockouts av sialyltransferasgener eller metabolisk blockad av sialinsyra med hjälp av sialinsyramimetika47,48,49. Icke desto mindre kan dessa metoder ge distinkta effekter på celler, och förutom desialylering måste cellviabiliteten beaktas. Enzymbehandlingen med sialidasenzym är en praktisk metod för att effektivt och kortvarigt avlägsna sialinsyror på cellytan samtidigt som cellviabiliteten bibehålls.
I detta arbete tillsattes sialidas till de omogna mo-DCs i koncentrationen 500 mU/5 x 106 celler/ml, och cellerna inkuberades vid 37 °C i 60 minuter. Behandlingen utfördes med RPMI-1640 utan serum för att bevara cellviabiliteten och undvika interaktion mellan de sialylerade molekylerna som finns i serum30. Silidasbehandling kan utföras med andra buffertar förutom RPMI, såsom 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (för C. perfingens sialidas) eller PBS50,51,52. Icke desto mindre är RPMI-1640 det vanligaste odlingsmediet för DCs eftersom det upprätthåller konstanta experimentella förhållanden under proceduren, undviker att inducera mognad och minskar eventuell stress som kan orsakas av sialidasbuffertar eller PBS53,54,55,56. Efter inkubation med sialidas är det viktigt att tvätta cellerna noggrant med ett serumtillsatt medium för att garantera att enzymreaktionen har upphört. Närvaron av sialylerade molekyler i serumet kommer att konkurrera som substrat för sialidas, vilket säkerställer ett snabbt reaktionsstopp.
Ytmarkörkarakterisering med flödescytometri och konfokalmikroskopi
För bestämning av sialinsyraprofilen, i protokollavsnitt 3, använde vi lektinfärgning följt av flödescytometri och konfokal laserskanningsmikroskopi. För cellfärgningsproceduren optimerades i båda fallen lektinkoncentrationerna och inkubationsförhållandena för att undvika cellagglutination och död. Det är viktigt att utföra inkubationen vid 4 °C i buffertar som innehåller minst 2 % av antingen FBS eller BSA för att undvika icke-specifik bindning av lektinerna. I detta protokoll användes RPMI-1640 innehållande 10 % FBS för att upprätthålla konstanta experimentella förhållanden och undvika cellstress. När det gäller konfokalmikroskopi är fixering av cellerna före färgning avgörande för att bevara morfologin, förhindra autolys och upprätthålla antigeniciteten.
Analysen av mo-DC-fenotypen med flödescytometri visade att sialidasbehandlade mo-DCs hade en signifikant högre mängd PNA-lektin bundet till cellytan jämfört med MMA- och SNA-lektiner, som minskade efter sialidasbehandlingen (Figur 2A). Som förväntat ökade PNA-färgningen, eftersom PNA känner igen icke-sialylerade antigener, till skillnad från MAA och SNA, som binder direkt till α2,3- respektive α2,6-sialinsyror30. Denna färgning bekräftar det effektiva avlägsnandet av sialinsyror från cellytan med hjälp av detta protokoll. En annan metod som kan användas för att validera behandlingen och analysera cellytans sialinsyrainnehåll är lektinfärgning följt av konfokalmikroskopi, som exemplifieras i figur 2B.
Förutom de förstnämnda exemplen finns det alternativa metoder för att utvärdera och karakterisera halten av sialinsyra, t.ex. lektinsondering genom western blotting. Det finns också alternativa sialinsyraspecifika lektiner, t.ex. Siglecs, en grupp lektiner som har en tydlig preferens för sialinsyratyper och kopplingar57. Förutom att använda lektiner i endera tekniken (flödescytometri, mikroskopi eller western blot), är det också möjligt att karakterisera sialinsyrahalten med hjälp av antikroppar; Till exempel kan α2,8-sialinsyror bedömas med antikroppar såsom klon 735, som är specifik för polysialinsyra58. Dessutom, efter sialidasbehandling, kan celler testas funktionellt för sin biologiska eller terapeutiska effektivitet genom att utvärdera deras fenotyp och förmåga att aktivera T-celler40. I själva verket, som visas i de angivna exemplen, uppvisade sialidasbehandlade mo-DCs högre mognadsfenotyp, såväl som ett förhöjt uttryck av antigenpresenterande och samstimulerande molekyler.
Dessutom kan sialidasbehandlade mo-DCs laddas med antigener och samodlas med T-celler eller andra celler och kan sedan studeras med avseende på fenotyp, cytokinsekretionsprofil eller andra egenskaper. I exemplet visar data att sialidasbehandlade mo-DCs kan laddas med tumörantigener och sedan användas för att aktivera T-celler. Faktum är att de resulterande T-cellerna visade ökad IFN-γ-utsöndring, vilket är i överensstämmelse med tidigare rapporter om effekten av sialinsyrabrist på att öka kapaciteten hos mo-DCs att aktivera T-celler 27,28,29,30,31.
Sammanfattningsvis visar detta protokoll en genomförbar, genomförbar och praktisk metod för att generera mo-DCs för manipulation av sialinsyrainnehåll genom behandling med sialidas. Detta protokoll presenterar en metod som kan tjäna olika syften och tillämpningar. Denna metod kan inte bara ha en avgörande roll för att förstå sialinsyrornas roll i immuncellernas mognad och respons utan kan också användas som ett immunmodulerande verktyg.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering från Europeiska kommissionen GLYCOTwinning GA 101079417 och EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, inom ramen för bidrag FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) och LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. och Stemmatters finansierades också av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), genom Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) för SI I& DT DCMatters-projektet (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi erkänner Biolabs anläggning vid FCT-NOVA och GLYCOVID NOVA Saude.
15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
BSA | Sigma – Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Density gradient medium (Histopaque) | Sigma – Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-1β | Sigma – Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-6 | Sigma – Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma – Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma – Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma – Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |