Summary

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Abstract

Volwassen zebravissen (Danio rerio) vertonen een rijk repertoire aan gedragingen voor het bestuderen van cognitieve functies. Ze hebben ook een miniatuurbrein dat kan worden gebruikt voor het meten van activiteiten in hersengebieden door middel van optische beeldvormingsmethoden. Rapporten over de registratie van hersenactiviteit bij zich gedragende volwassen zebravissen zijn echter schaars. De huidige studie beschrijft procedures om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen. We richten ons op stappen om te voorkomen dat volwassen zebravissen hun kop bewegen, wat zorgt voor stabiliteit die laserscanning van de hersenactiviteit mogelijk maakt. De dieren met hun hoofd kunnen hun lichaamsdelen vrij bewegen en ademen zonder hulpmiddelen. De procedure heeft tot doel de tijd van een hoofdsteunoperatie te verkorten, de hersenbeweging te minimaliseren en het aantal geregistreerde neuronen te maximaliseren. Hier wordt ook een opstelling beschreven voor het presenteren van een meeslepende visuele omgeving tijdens calciumbeeldvorming, die kan worden gebruikt om neurale correlaten te bestuderen die ten grondslag liggen aan visueel getriggerd gedrag.

Introduction

Calciumfluorescentiebeeldvorming met genetisch gecodeerde indicatoren of synthetische kleurstoffen is een krachtige methode geweest om neuronale activiteit te meten bij zich gedragende dieren, waaronder niet-menselijke primaten, knaagdieren, vogels eninsecten. De activiteit van honderden cellen, tot ongeveer 800 μm onder het hersenoppervlak, kan tegelijkertijd worden gemeten met behulp van multi-fotonbeeldvorming 2,3. De activiteit van specifieke celtypen kan ook worden gemeten door calciumindicatoren tot expressie te brengen in genetisch gedefinieerde neuronale populaties. Toepassing van de beeldvormingsmethode voor kleine gewervelde modellen opent nieuwe mogelijkheden op het gebied van neuronale berekeningen over hersengebieden.

Zebravissen zijn een veelgebruikt modelsysteem in neurowetenschappelijk onderzoek. Larvale zebravissen zijn ongeveer 6 dagen na de bevruchting gebruikt voor calciumbeeldvorming vanwege hun miniatuurhersenen en transparante lichaam4. Juveniele zebravissen (3-4 weken oud) worden ook gebruikt voor het bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan sensomotorische routes 5,6. Het maximale prestatieniveau voor complex gedrag, waaronder associatief leren en sociaal gedrag, wordt echter bereikt op een oudere leeftijd 7,8 jaar. Er is dus een betrouwbaar protocol nodig om meerdere cognitieve functies in de hersenen van volwassen zebravissen te bestuderen met behulp van beeldvormingsmethoden. Terwijl zebravislarven en juveniele zebravissen kunnen worden ingebed in agarose voor in vivo beeldvorming, lijden volwassen zebravissen van 2 maanden of ouder in dergelijke omstandigheden aan hypoxie en zijn ze fysiek te sterk om door agarose te worden tegengehouden. Daarom is een chirurgische ingreep nodig om de hersenen te stabiliseren en het dier vrij door de kieuwen te laten ademen.

Hier beschrijven we een hoofdsteunprotocol dat een nieuw ontwerp van een enkele hoofdbeugel omvat. De verkorte operatietijd van 25 minuten is twee keer zo snel als de vorige methode9. We beschrijven ook het ontwerp van de opnamekamer (semi-zeshoekige tank), de hoofdtrap en een snelvergrendelingsmechanisme om de twee delen te combineren9. Ten slotte wordt ook de opstelling beschreven om een meeslepende visuele stimulus te presenteren om visueel getriggerde hersenactiviteit en -gedrag te bestuderen. Over het algemeen kunnen de hier beschreven procedures worden gebruikt om calciumbeeldvorming met twee fotonen uit te voeren in genetisch gedefinieerde celpopulaties in een volwassen zebravis met een hoofd, waardoor hersenactiviteiten tijdens verschillende gedragsparadigma’s kunnen worden onderzocht.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van Academia Sinica. Details van de onderzoeksinstrumenten zijn te vinden in de Materiaaltabel. 1. Voorbereiding van de opnamekamer Bereid een semi-zeshoekige tank, een grondplaat en een hoofdtrap voor (Figuur 1A; Aanvullende bestanden 1-3). Het hoofdpodium bestaat uit …

Representative Results

Het protocol bestaat uit twee delen: een hoofdsteunoperatie en twee-foton calciumbeeldvorming van neuronale activiteiten in de voorhersenen. Het succes van een operatie wordt bepaald door de overleving van het dier en de stabiliteit van de hoofdsteun. Het overlevingspercentage kan sterk worden verbeterd door frequente perfusie van 0,01% TMS-oplossing via de mond tijdens de operatie. Vissen moeten herstellen van de anesthesie en actief ademen binnen 1-2 minuten nadat ze in aquariumwater zijn ondergedompeld. Calciumbeeldvo…

Discussion

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de kop van volwassen zebravissen in bedwang te houden voor calciumbeeldvorming met twee fotonen. Er zijn twee cruciale stappen om een hoofdsteun te krijgen die stabiel genoeg is voor laserscanning. Eerst moet de hoofdbalk op de specifieke bevestigingsplaatsen van de schedels worden gelijmd. Andere delen van de schedel zijn vaak te dun om mechanische stabiliteit te bieden en kunnen zelfs worden gebroken tijdens sterke lichaamsbewegingen. Ten tweede moet de huid boven de aa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, en de National Science and Technology Council, Taiwan. De machinewerkplaats van het Institute of Physics, Academia Sinica, hielp bij het vervaardigen van op maat ontworpen onderdelen. We willen ook P. Argast (Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, Basel, Zwitserland) bedanken voor het ontwerp van het snelsluitmechanisme van de hoofdstage.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

References

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
  5. Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
  6. Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
  7. Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
  8. Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
  9. Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  10. Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
  11. Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
  12. Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
check_url/kr/65526?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

View Video