Summary

Imagerie calcique à deux photons de l’activité du cerveau antérieur chez le poisson-zèbre adulte

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’effectuer une imagerie calcique à deux photons dans le cerveau antérieur dorsal du poisson-zèbre adulte.

Abstract

Le poisson-zèbre adulte (Danio rerio) présente un riche répertoire de comportements pour l’étude des fonctions cognitives. Ils ont également un cerveau miniature qui peut être utilisé pour mesurer les activités dans les régions du cerveau grâce à des méthodes d’imagerie optique. Cependant, les rapports sur l’enregistrement de l’activité cérébrale chez les poissons-zèbres adultes ont été rares. La présente étude décrit les procédures permettant d’effectuer une imagerie calcique à deux photons dans le cerveau antérieur dorsal du poisson-zèbre adulte. Nous nous concentrons sur les mesures à prendre pour empêcher les poissons-zèbres adultes de bouger la tête, ce qui offre une stabilité qui permet l’imagerie par balayage laser de l’activité cérébrale. Les animaux dont la tête est attachée peuvent bouger librement les parties de leur corps et respirer sans aide. La procédure vise à raccourcir la durée de la chirurgie d’appuie-tête, à minimiser les mouvements du cerveau et à maximiser le nombre de neurones enregistrés. Une configuration permettant de présenter un environnement visuel immersif pendant l’imagerie calcique est également décrite ici, ce qui peut être utilisé pour étudier les corrélats neuronaux sous-jacents aux comportements déclenchés visuellement.

Introduction

L’imagerie par fluorescence de calcium avec des indicateurs génétiquement codés ou des colorants synthétiques a été une méthode puissante pour mesurer l’activité neuronale chez les animaux qui se comportent, y compris les primates non humains, les rongeurs, les oiseaux et les insectes1. L’activité de centaines de cellules, jusqu’à environ 800 μm sous la surface du cerveau, peut être mesurée simultanément à l’aide de l’imagerie multiphotonique 2,3. L’activité de types cellulaires spécifiques peut également être mesurée en exprimant des indicateurs calciques dans des populations neuronales génétiquement définies. L’application de la méthode d’imagerie à des modèles de petits vertébrés ouvre de nouvelles possibilités dans le domaine du calcul neuronal à travers les régions du cerveau.

Le poisson-zèbre est un système modèle largement utilisé dans la recherche en neurosciences. Les larves de poisson-zèbre environ 6 jours après la fécondation ont été utilisées pour l’imagerie calcique en raison de leur cerveau miniature et de leur corps transparent4. Les poissons-zèbres juvéniles (âgés de 3 à 4 semaines) sont également utilisés pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents aux voies sensorimotrices 5,6. Cependant, le niveau de performance maximal pour les comportements complexes, y compris l’apprentissage associatif et les comportements sociaux, est atteint à un âge plus avancé de 7,8 ans. Ainsi, un protocole fiable est nécessaire pour étudier de multiples fonctions cognitives dans le cerveau des poissons-zèbres adultes à l’aide de méthodes d’imagerie. Alors que les larves de poisson-zèbre et les poissons-zèbres juvéniles peuvent être intégrés dans l’agarose pour l’imagerie in vivo, les poissons-zèbres adultes âgés de 2 mois ou plus souffrent d’hypoxie dans de telles conditions et sont physiquement trop forts pour être retenus par l’agarose. Par conséquent, une intervention chirurgicale est nécessaire pour stabiliser le cerveau et permettre à l’animal de respirer librement par les branchies.

Ici, nous décrivons un protocole d’appuie-tête qui implique une nouvelle conception d’une seule barre de tête. Le temps de chirurgie réduit de 25 min est deux fois plus rapide que la méthode précédente9. Nous décrivons également la conception de la chambre d’enregistrement (cuve semi-hexagonale), de la scène principale et d’un mécanisme de verrouillage rapide pour combiner les deux parties9. Enfin, la configuration permettant de présenter un stimulus visuel immersif pour étudier l’activité cérébrale et les comportements déclenchés visuellement est également décrite. Dans l’ensemble, les procédures décrites ici peuvent être utilisées pour effectuer une imagerie calcique à deux photons dans des populations cellulaires génétiquement définies chez un poisson-zèbre adulte à tête retenue, ce qui permet d’étudier les activités cérébrales au cours de divers paradigmes comportementaux.

Protocol

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées et effectuées conformément aux directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Academia Sinica. Les détails des outils de recherche se trouvent dans le tableau des matériaux. 1. Préparation de la chambre d’enregistrement Préparez un réservoir semi-hexagonal, une plaque de base et une platine de tête (Figure 1A</st…

Representative Results

Le protocole se compose de deux parties : la chirurgie d’appuie-tête et l’imagerie calcique à deux photons des activités neuronales dans le cerveau antérieur. Le succès d’une intervention chirurgicale est défini par la survie de l’animal et la stabilité de l’appuie-tête. Le taux de survie peut être grandement amélioré par une perfusion fréquente de solution de SMT à 0,01 % par voie buccale pendant la chirurgie. Les poissons doivent se remettre de l’anesthésie et respirer activement dans les 1 à…

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour retenir la tête du poisson-zèbre adulte pour l’imagerie calcique à deux photons. Il y a deux étapes essentielles pour obtenir un appuie-tête suffisamment stable pour l’imagerie par balayage laser. Tout d’abord, la barre de tête doit être collée aux sites de fixation spécifiques des crânes. D’autres parties du crâne sont souvent trop minces pour assurer une stabilité mécanique et peuvent même être fracturées lors de mouvements corporels importants. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’Institut de biologie moléculaire, l’Academia Sinica et le Conseil national de la science et de la technologie de Taïwan. L’atelier d’usinage de l’Institut de physique de l’Academia Sinica a contribué à la fabrication de pièces conçues sur mesure. Nous tenons également à remercier P. Argast (Institut Friedrich Miescher pour la recherche biomédicale, Bâle, Suisse) pour la conception du mécanisme de verrouillage rapide de la scène de tête.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

References

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
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Cite This Article
Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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