Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering
Summary
Er wordt een protocol gepresenteerd voor het verrijken van gastheerceleiwitten (HCP’s) uit geneesmiddelen (DP) en het detecteren van peptiden met behulp van proteoomverrijkingskorrels. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van een in-house vervaardigde monoklonale antilichaam (mAb) geneesmiddelsubstantie (DS), die een goed gekarakteriseerd referentiemateriaal is voor het evalueren en vergelijken van verschillende methoden in termen van prestaties.
Abstract
Gastheerceleiwitten (HCP’s) zijn onzuiverheden die therapeutische eiwitten nadelig kunnen beïnvloeden, zelfs in kleine hoeveelheden. Om de potentiële risico’s van geneesmiddelen te evalueren, zijn methoden ontwikkeld om HCP’s met een lage abundantie te identificeren. Een cruciale benadering voor het ontwikkelen van een gevoelige HCP-detectiemethode is het verrijken van HCP’s en tegelijkertijd het verwijderen van monoklonale antilichamen (mAbs) vóór analyse, met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS).
Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het verrijken van gastheerceleiwitten met behulp van in de handel verkrijgbare proteoomverrijkingskorrels. Deze kralen bevatten een gevarieerde bibliotheek van hexapeptideliganden met specifieke affiniteiten voor verschillende eiwitten. Het protocol omvat ook beperkte vertering en daaropvolgende peptidedetectie met behulp van nano LC-MS/MS. Door gebruik te maken van deze technieken kunnen HCP’s met een lage abundantie meer dan 7000 keer worden verrijkt, wat resulteert in een indrukwekkende detectielimiet van slechts 0,002 ppm. Belangrijk is dat dit protocol de detectie van 850 HCP’s met een hoge mate van betrouwbaarheid mogelijk maakt met behulp van een NIST-mAb. Bovendien is het ontworpen om gebruiksvriendelijk te zijn en bevat het een videodemonstratie om te helpen bij de implementatie ervan. Door deze stappen te volgen, kunnen onderzoekers HCP’s effectief verrijken en detecteren, waardoor de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de risicobeoordeling voor geneesmiddelen wordt verbeterd.
Introduction
Gastheerceleiwitten (HCP’s) zijn onzuiverheden die vrijkomen uit de celkweek van het gastheerorganisme en samen met monoklonaal antilichaam (mAb) worden gezuiverd1,2,3,4. Sporenniveaus van HCP’s kunnen een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van het geneesmiddel 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, en daarom is een gevoelige HCP-analysemethode gewenst om HCP’s te detecteren in sub-ppm tot ppm-niveaus.
Orthogonale methoden kunnen worden toegepast om HCP’s in lage hoeveelheden te detecteren. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt over het algemeen gebruikt om het totale aantal HCP’s te kwantificeren, en het kan ook individuele HCP’s detecteren en kwantificeren als de overeenkomstige antilichamen beschikbaar zijn16. De productie van HCP-specifieke antilichamen is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (LC-MS) kan daarentegen uitgebreide informatie verschaffen over individuele HCP’s in mAb-geneesmiddelen en wordt veel toegepast voor HCP-identificatie 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om HCP’s met LC-MS/MS te detecteren, waaronder beperkte spijsvertering20, filtratie17, proteïne A-deletie21, immunoprecipitatie (IP) en ProteoMiner-verrijking (PM)18. De meeste methoden zijn gericht op het verminderen van de hoeveelheid mAb en het verrijken van HCP’s voorafgaand aan LC-MS/MS-analyse, waardoor het dynamische bereik tussen mAb-peptiden en HCP-peptiden wordt verkleind. Dit protocol presenteert een proteomische monsterverrijkingsmethode die ProteoMiner-technologie combineert met beperkte vertering (PMLD)28. Het ProteoMiner-verrijkingsprincipe omvat het gebruik van in de handel verkrijgbare proteoomverrijkingskorrels die een gevarieerde bibliotheek van combinatorische peptideliganden bevatten. Deze liganden binden zich specifiek aan eiwitten op antilichaam-geneesmiddelen, waardoor overtollige moleculen kunnen worden verwijderd terwijl gastheerceleiwitten met een lage abundantie (HCP’s) worden geconcentreerd op hun respectievelijke affiniteitsliganden. Aan de andere kant omvat het principe van beperkte spijsvertering het gebruik van een lage concentratie trypsine. Deze concentratie is voldoende om HCP’s met een lage abundantie te verteren, maar niet genoeg om alle antilichaamgeneesmiddelen te verteren. Deze aanpak maakt het mogelijk om verteerde HCP-peptiden uit de oplossing terug te winnen en te verrijken.
In vergelijking met filtratiemethoden wordt de PMLD-techniek niet beperkt door de grootte van de gedetecteerde HCP’s17. Proteïne A-deletiemethoden zijn specifiek voor het detecteren van HCP’s geassocieerd met antilichamen21, terwijl immunoprecipitatie beperkt is tot vooraf gedefinieerde HCP’s van een bepaalde cellijn (zoals de cellijn van de Chinese hamstereierstok (CHO), waar een anti-HCP-antilichaam werd gegenereerd4. PMLD daarentegen kan worden toegepast om HCP’s te detecteren van alle geneesmiddelmodules en gastheerceleiwitten die samen met geneesmiddelen uit verschillende cellijnen zijn gezuiverd. Bovendien vertoont PMLD een betere gevoeligheid in vergelijking met de genoemde methoden 17,18,20,21,24.
Deze aanpak kan de HCP-concentratie met een factor 7000 verrijken en de detectielimiet verlagen tot 0,002 ppm28. De experimentele opzet wordt geïllustreerd in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee versies van in de handel verkrijgbare eiwitverrijkingskorrels: een met een kleinere capaciteit en de andere met een grotere capaciteit (zie Materiaaltabel). Beide versies van de verrijkingskralen bevatten tien preps in de verpakking. De instructies van de fabrikant suggereren dat elke prep uit de kit met kleine capaciteit kan worden gebruikt om 10 mg totaal eiwit te verrijken. Voor optimale prestaties van de verrijking van gastheerceleiwit (HCP) van DS is elke prep echter goed voor vijf DS-m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
