Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi
Summary
İlaç ürünlerinden (DP) konak hücre proteinlerini (HCP’ler) zenginleştirmek ve proteom zenginleştirme boncukları kullanarak peptitleri tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, performans açısından farklı yöntemleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için iyi karakterize edilmiş bir referans materyal olan, kurum içinde üretilmiş bir monoklonal antikor (mAb) ilaç maddesi (DS) kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Konak hücre proteinleri (HCP’ler), küçük miktarlarda bile terapötik proteinleri olumsuz yönde etkileyebilen safsızlıklardır. İlaç ürünleriyle ilişkili potansiyel riskleri değerlendirmek için, düşük bolluğa sahip HCP’leri belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmiştir. Hassas bir HCP tespit yöntemi geliştirmek için çok önemli bir yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) kullanılarak analizden önce monoklonal antikorları (mAb’ler) giderirken aynı anda HCP’leri zenginleştirmeyi içerir.
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen proteom zenginleştirme boncuklarını kullanarak konak hücre proteinlerini zenginleştirmek için ayrıntılı talimatlar sunar. Bu boncuklar, farklı proteinler için spesifik afinitelere sahip çeşitli hekzapeptid ligandları kütüphanesi içerir. Protokol ayrıca nano LC-MS/MS kullanılarak sınırlı sindirim ve müteakip peptit tespitini içerir. Bu teknikler kullanılarak, düşük bolluğa sahip HCP’ler 7000 kattan fazla zenginleştirilebilir ve bu da 0,002 ppm gibi etkileyici bir tespit limiti ile sonuçlanır. Önemli bir şekilde, bu protokol bir NIST mAb kullanarak 850 HCP’nin yüksek düzeyde güvenle tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcı dostu olacak şekilde tasarlanmıştır ve uygulanmasına yardımcı olacak bir video gösterimi içerir. Araştırmacılar bu adımları izleyerek, HCP’leri etkili bir şekilde zenginleştirebilir ve tespit edebilir, ilaç ürünleri için risk değerlendirmesinin hassasiyetini ve doğruluğunu artırabilir.
Introduction
Konak hücre proteinleri (HCP’ler), konakçı organizmanın hücre kültüründen salınan ve monoklonal antikor (mAb) ile birlikte saflaştırılan safsızlıklardır1,2,3,4. HCP’lerin eser seviyeleri, ilaç ürünü 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 kalitesini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, HCP’leri ppm’nin altında ve ppm seviyelerinde tespit etmek için hassas bir HCP analiz yöntemi istenmektedir.
Düşük bolluktaki HCP’leri tespit etmek için ortogonal yöntemler uygulanabilir. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) genellikle genel HCP’leri ölçmek için kullanılır ve ayrıca karşılık gelen antikorlar mevcutsa bireysel HCP’leri tespit edebilir ve ölçebilir16. Bununla birlikte, HCP’ye özgü antikorların üretimi zaman alıcı ve emek yoğundur. Buna karşılık, kütle spektrometrisi (LC-MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, mAb ilaç ürünlerindeki bireysel HCP’ler hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilir ve HCP tanımlaması için yaygın olarak uygulanır 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Sınırlı sindirim20, filtrasyon17, Protein A delesyonu21, immünopresipitasyon (IP) ve ProteoMiner zenginleştirme (PM)18 dahil olmak üzere LC-MS/MS’li HCP’leri tespit etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çoğu yöntem, LC-MS/MS analizinden önce mAb miktarını azaltmayı ve HCP’leri zenginleştirmeyi, böylece mAb peptitleri ile HCP peptitleri arasındaki dinamik aralığı azaltmayı amaçlar. Bu protokol, ProteoMiner teknolojisini ve sınırlı sindirimi (PMLD)28 birleştiren bir proteomik numune zenginleştirme yöntemi sunar. ProteoMiner zenginleştirme prensibi, çeşitli kombinatoryal peptit ligandları kütüphanesi içeren ticari olarak temin edilebilen proteom zenginleştirme boncuklarının kullanılmasını içerir. Bu ligandlar, antikor-ilaç ürünlerindeki proteinlere spesifik olarak bağlanarak, düşük bolluktaki konakçı hücre proteinlerini (HCP’ler) ilgili afinite ligandlarına konsantre ederken fazla moleküllerin uzaklaştırılmasına izin verir. Öte yandan, sınırlı sindirim ilkesi, düşük konsantrasyonda tripsin kullanmayı içerir. Bu konsantrasyon, düşük bolluktaki HCP’leri sindirmek için yeterlidir, ancak tüm antikor ilaç ürünlerini sindirmek için yeterli değildir. Bu yaklaşım, sindirilmiş HCP peptitlerinin çözeltiden geri kazanılmasını ve zenginleştirilmesini sağlar.
Filtrasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PMLD tekniği tespit edilen HCP’lerin büyüklüğü ile sınırlı değildir17. Protein A delesyon yöntemleri, antikorlar21 ile ilişkili HCP’leri tespit etmeye özgüdür, immünopresipitasyon, bir anti-HCP antikorunun üretildiği belirli bir hücre hattından (Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücre hattı gibi) önceden tanımlanmış HCP’lerle sınırlıdır4. Buna karşılık, PMLD, herhangi bir ilaç modülünden HCP’leri ve çeşitli hücre hatlarından ilaç ürünleri ile birlikte saflaştırılmış konak hücre proteinlerini tespit etmek için uygulanabilir. Ek olarak, PMLD belirtilen yöntemlere kıyasla daha iyi duyarlılık gösterir 17,18,20,21,24.
Bu yaklaşım, HCP konsantrasyonunu 7000 kat zenginleştirebilir ve tespit sınırını 0,002 ppm28’e düşürebilir. Deney düzeneği Şekil 1’de gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ticari olarak temin edilebilen protein zenginleştirme boncuklarının iki versiyonu vardır: biri daha küçük kapasiteli, diğeri daha büyük kapasiteli (bkz. Zenginleştirme boncuklarının her iki versiyonu da pakette on hazırlık içerir. Üreticinin talimatları, küçük kapasiteli kitten elde edilen her bir hazırlığın 10 mg toplam proteini zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, DS’den konak hücre proteini (HCP) zenginleştirmesinin optimum performa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
