مضان الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين لتوطين الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في خلايا الساركوما العظمية البشرية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة مضان الحمض النووي الريبي في الموقع للتهجين لتوطين lncRNAs في خلايا الساركوما العظمية البشرية.
Abstract
تمت دراسة الأدوار المهمة للحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) في السرطان ، مثل تنظيم الانتشار ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ، والهجرة ، والتسلل ، والالتهام الذاتي للخلايا السرطانية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا نظرة ثاقبة لوظائفها. من خلال تصميم تسلسل سلسلة مضادات الحساسية الخاصة ب lncRNA متبوعا بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت ، يمكن تطبيق مضان الحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) للكشف عن التوطين الخلوي ل lncRNAs. جنبا إلى جنب مع تطوير الفحص المجهري ، تسمح تقنيات RNA FISH الآن بتصور lncRNAs التي تم التعبير عنها بشكل سيئ. لا يمكن لهذه الطريقة اكتشاف توطين lncRNAs وحدها فحسب ، بل يمكنها أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان. هنا ، قمنا بتضمين إجراء التشغيل التجريبي التفصيلي واحتياطات RNA FISH باستخدام الجين المضيف للحمض النووي الريبي lncRNA الصغير 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية البشرية (143B) كمثال ، لتوفير مرجع للباحثين الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH ، وخاصة lncRNA FISH.
Introduction
لقد تم توسيع فهمنا للجينوم البشري بشكل كبير من خلال التطورات الحديثة في تكنولوجيا الجينوم الكامل. يمكن نسخ حوالي 93٪ من الجينوم البشري إلى الحمض النووي الريبي ، ولكن يمكن ترجمة 2٪ فقط من الحمض النووي الريبي إلى بروتينات. تسمى 98٪ المتبقية من الحمض النووي الريبي التي ليس لها وظيفة ترجمة البروتين الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA) 1. كفئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNAs) ، جذبت ncRNAs الطويلة (lncRNAs) ، التي تحتوي على أكثر من 200 نيوكليوتيدات2 ، اهتماما متزايدا بسبب مشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية للخلايا ، مثل التمايز ، والتحكم في الدورة ، وموت الخلايا المبرمج ، والهجرة ، والغزو3،4،5. تلعب LncRNAs أدوارها من خلال آليات مختلفة ، مثل تنظيم بنية الكروماتين والتعبير الجيني النووي ، والتحكم في عملية ربط mRNA ، وتعديل ما بعد النسخ6. تنظم LncRNAs حدوث الأورام الخبيثة وتطورها وانتشارها على مستوى النسخ وما بعد النسخ. يتم تحقيق تنظيم النسخ في النواة من خلال التأثير على نسخ الحمض النووي الريبي عن طريق الارتباط بالهياكل الكروموسومية ، بينما يتحقق تنظيم ما بعد النسخ في السيتوبلازم عن طريق التحكم في الجينات المستهدفة عبر آلية RNA تنافسية داخلية المنشأ (ceRNA)5،7،8. كشف CeRNA عن آلية جديدة لتفاعل الحمض النووي الريبي ، وهي أن lncRNAs يمكن أن تعمل كإسفنجة لامتصاص miRNAs وتثبيط التدهور بوساطة miRNA للجينات المستهدفة ذات الصلة9. لذلك ، فإن المعلومات المتعلقة بالتوطين تحت الخلوي ل lncRNAs ، سواء كان lncRNA معينا موجودا في السيتوبلازم أو النواة ، مهمة للمساعدة في تحديد وظائفها البيولوجية.
في الوقت الحاضر ، يتم الكشف عن توطين lncRNA بشكل أساسي بطريقتين ، واحدة عن طريق مقايسة عزل جزء النواة / السيتوبلازم ، والأخرى بواسطة RNA FISH. في السابق ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم والكسور النووية على التوالي ، ثم يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات lncRNA محددة للكشف عن نسبة lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. ميزة هذه الطريقة هي كفاءة الوقت ، في حين أن العيب هو أن توطين lncRNA الفعلي لا ينعكس مباشرة من خلال النسبة النسبية ل lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA في الخلايا من خلال تصميم تسلسلات سلسلة مضادة للحساسية خاصة ب lncRNA متبوعة بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت10. تم تحسين طرق RNA FISH مع التقدم في تقنيات المسبار وطرق الكشف ، بما في ذلك مجموعات مسبار oligo المتعددة ذات العلامات الفلوروفور 11 ، ومجسات LNA12 ، ومجسات الحمض النووي المتفرعة (bDNA)13. لا يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان14.
في هذا العمل ، قمنا بتضمين بروتوكول الكشف عن التوطين المفصل داخل الخلايا للجين المضيف للحمض النووي الريبي الصغير lncRNA 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية (143B) بواسطة RNA FISH كمثال. SNHG6 هو 600-730 نيوكليوتيد lncRNA في شكله الناضج المقسم ويتم تحديده على أنه جين ورمي جديد في سرطانات بشرية متنوعة ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم وسرطان المعدة وسرطان الخلايا الصافية المبيض وساركوما العظام وسرطان الخلايا الكبدية15،16،17،18. أكدت الدراسات تورط SNHG6 في السلوكيات البيولوجية للخلايا السرطانية ، مثل الانتشار ، EMT ، والالتهام الذاتي ، وأظهرت توطين السيتوبلازم ل SNHG6 حيث قد يؤثر على الجينات المستهدفة عن طريق ربط (إسفنجة) miRNAs15،16،17. يتم تقديم بروتوكول الكشف التفصيلي هذا للتوطين داخل الخلايا SNHG6 بواسطة RNA FISH هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يمكن لبروتوكول RNA FISH هذا اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها أيضا للكشف عن موقع lncRNAs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المحدد في مثل هذه ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل بمنح من (1) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ؛ (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ؛ (3) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي للمستشفى ؛ (4) المشاريع البحثية في حدود ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
